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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】荧光PCR扩增曲线问题
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love_st

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】荧光PCR扩增曲线问题

我的一对引物探针，高浓度的扩增没有问题，而低浓度却扩增不好，荧光信号很低，为什么？图中那两条扩增曲线是模板浓度十倍稀释的！请大家帮我看看哦！
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1楼 2010-12-08 16:59:29
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
love_st(金币+7):谢谢，我想改变下引物或许有好的结果 2010-12-09 15:39:13
引用回帖:
Originally posted by love_st at 2010-12-09 11:44:35:

ABI7500的，染料是FAM，荧光值和模板浓度一般也是会呈现梯度下降的，这个下降的太多了，所以图形很难看，我想知道或者想讨论的是，什么因素导致低浓度的扩增效率不高，我想可能是我的引物本身的问题，那么能否改 ...

低浓度模板扩增效率问题是一个普遍的现象，和引物质量有直接关系

1，不管有没有扩增出目的片段，只要里边有模板，从第一个循环开始就会消耗引物，而且模板越多越复杂，消耗就越大，基因组远大于质粒的消耗。这样30个循环下来就消耗了大量的引物，越往后效率越低是难免的

2，引物的初始浓度也不能太高了，太高了就会增加非特异性和二聚体等杂带

3，如果引物本身的质量不是特别好，经过30轮的折腾，里边难免会形成一些引物自身的二级结构导致引物序列的改变（taq酶是很厉害的，只要有一点点的机会，他也能给你往上添加碱基。这个你应该可以理解）

所以，以上三点不难看出，为什么大家都知道低浓度模板扩增效果差，却无法解决了

貌似你的问题如果想彻底解决，推荐换一对更好的引物。

不过半对数的图也行会更好

个人观点
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9楼2010-12-09 15:10:04
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love_st

金虫 (著名写手)
自己顶顶
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2楼2010-12-09 08:41:40
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
love_st(金币+1):谢谢交流 2010-12-09 08:59:09
做了几个复孔啊， 第二条明显不对啊
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3楼2010-12-09 08:50:27
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-09 08:50:27:
做了几个复孔啊， 第二条明显不对啊

做了很多重复，这对引物探针就是这样，高浓度的模板扩增挺好，就是低浓度的模板突然不呈梯度的荧光信号突然下降的厉害，体系优化似乎也优化不出来
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4楼2010-12-09 08:58:53
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
最好还是多些数据，两条线不太好分析啊

[ Last edited by silicare on 2010-12-9 at 09:50 ]
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5楼2010-12-09 10:32:21
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-09 10:32:21:
最好还是多些数据，两条线不太好分析啊

[ Last edited by silicare on 2010-12-9 at 09:50 ]

你看下图
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6楼2010-12-09 12:25:34
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
love_st(金币+2): 2010-12-09 12:44:45
什么机子什么染料（探针标记染料）啊，荧光值现实好高啊

浓度低了的时候，ct值超过30的时候都容易出现这种情况

不知你这事rn还是delta rn

貌似ct值还比较正常，你换成半对数图看看吧，那样应该更直观好看一些
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7楼2010-12-09 12:32:54
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-09 12:32:54:
什么机子什么染料（探针标记染料）啊，荧光值现实好高啊

浓度低了的时候，ct值超过30的时候都容易出现这种情况

不知你这事rn还是delta rn

貌似ct值还比较正常，你换成半对数图看看吧，那样应该更直观好看 ...

ABI7500的，染料是FAM，荧光值和模板浓度一般也是会呈现梯度下降的，这个下降的太多了，所以图形很难看，我想知道或者想讨论的是，什么因素导致低浓度的扩增效率不高，我想可能是我的引物本身的问题，那么能否改变什么条件能改善呢？
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8楼2010-12-09 12:44:35
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wps1234

新虫 (初入文坛)
★
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很可能是试剂与一起不匹配，重新优化下反应液吧
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10楼2012-06-07 18:58:54
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wps1234

新虫 (初入文坛)
试剂与仪器不匹配，优化下反应液吧
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11楼2012-06-07 18:59:25
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大甫哥

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇到同样的问题，我们实验室的师姐建议我换一种酶试试，可我哪知道换什么酶效果好啊？
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12楼2014-06-12 08:32:37
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 大甫哥 at 2014-06-12 08:32:37
我也遇到同样的问题，我们实验室的师姐建议我换一种酶试试，可我哪知道换什么酶效果好啊？

好点的热启动酶，不过这个问题我已经解决，换了个引物
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13楼2014-06-12 08:50:39
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大甫哥

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by love_st at 2014-06-12 08:50:39
好点的热启动酶，不过这个问题我已经解决，换了个引物...

我的是标准品质粒，浓度高时无引物二聚体，但当降到10^4拷贝就出现引物二聚体了，查询网上说的有加二甲亚砜的，有说优化体系的，还有的说引物二聚体基本难以避免换引物。
      优化体系你是用正交设计吗？还是固定其他条件，只变其中一个？
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14楼2014-06-12 09:50:34
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大甫哥

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我用的是taqman探针法，
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15楼2014-06-12 09:55:59
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 大甫哥 at 2014-06-12 09:55:59
我用的是taqman探针法，

探针法你怎么知道有引物二聚体？
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16楼2014-06-12 10:09:03
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大甫哥

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by love_st at 2014-06-12 10:09:03
探针法你怎么知道有引物二聚体？...

扩增结果跑了个胶，发现低浓度的样品孔均有大小相同的条带，
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17楼2014-06-12 10:12:39
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 大甫哥 at 2014-06-12 10:12:39
扩增结果跑了个胶，发现低浓度的样品孔均有大小相同的条带，...

只要荧光PCR影响不大就OK，如果你也像我上面的情况，建议你更换引物
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18楼2014-06-12 10:21:25
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枫素

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by 大甫哥 at 2014-06-12 09:50:34
我的是标准品质粒，浓度高时无引物二聚体，但当降到10^4拷贝就出现引物二聚体了，查询网上说的有加二甲亚砜的，有说优化体系的，还有的说引物二聚体基本难以避免换引物。
      优化体系你是用正交设计吗？还是固 ...

我做的也是质粒标准品，标准曲线一直做不好，求教
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19楼2015-07-10 17:47:30
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