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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教两条片段通过PCR桥接扩增的方法
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noheartman

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请教两条片段通过PCR桥接扩增的方法 已有9人参与

我有两段DNA，其中一段1.5Kb,另外一段只有60bp,想通过PCR桥接的方法把它们连接起来再进行扩增，想得到1500+60的片段，请教大虾，该怎么做才好。本来计划通过单独的PCR加酶切位点扩增后，胶回收连接起来，但60bp的DNA回收起来有困难，要不有好的回收方法也可以，请赐教。
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1楼 2010-07-27 21:54:24
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hyw1989960

木虫 (正式写手)

快乐家族二十八
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-07-27 23:43:27
第二个片段也太小了，做融合PCR也不好做，1500与1500+60估计电泳也看不出区别
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快乐家族
2楼2010-07-27 21:59:29
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
★
noheartman(金币+1): 2010-07-28 15:25:09
lstt09nk(金币+1):正解~~ 2010-07-29 09:34:37
确实不太好办，你干脆直接把60bp合成引物算了。
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3楼2010-07-27 23:14:27
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)
noheartman(金币+1): 2010-07-28 15:25:02
同意二楼
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4楼2010-07-28 00:16:16
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jasco

木虫 (正式写手)
noheartman(金币+1): 2010-07-28 15:24:59
引用回帖:
Originally posted by sunyongle1 at 2010-07-27 23:14:27:
确实不太好办，你干脆直接把60bp合成引物算了。

这个才是正解！
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5楼2010-07-28 11:31:03
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
noheartman(金币+1): 2010-07-28 15:24:48
同意直接合成一条八十几个碱基的长引物（与长序列有20多个bp的重叠区），然后跟长序列上的引物PCR就可以。。。
    短片段回收 直接乙醇沉淀就行。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
6楼2010-07-28 11:36:58
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steamsn

金虫 (小有名气)
noheartman(金币+1): 2010-07-28 15:24:54
同意楼上的意见，直接将其作为引物的来进行PCR
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我命由我不由天
7楼2010-07-28 11:38:42
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noheartman

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-07-28 11:31:03:


这个才是正解！

80多个碱基的引物，我以前没有做过，那Tm值会超高，那是不是只要两步法呢，退火和延伸合并成一步呢？
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8楼2010-07-28 15:32:14
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zxping11230

铁虫 (小有名气)
如果模板是质粒的话，80多个碱基的引物可以与30多的常规引物搭配的，我经常这样做 没问题。而且简单，只是扩增时最好用高保真酶！
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快乐的科研
9楼2010-07-28 17:24:02
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zxping11230

铁虫 (小有名气)
没必要两步法，就常规PCR
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快乐的科研
10楼2010-07-28 17:25:25
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