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lyta0

木虫 (小有名气)

[求助] 大片段PCR扩增求助

我要扩增一个片段为3623bp的DNA,条件如下:98℃1分钟,然后是四十个循环:98℃10秒,52℃10秒,68℃3分30秒,最后是68℃6分钟,扩了好几次都失败,求助各位高手
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【分子生物】EPI帖 实验求助

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lyta0

木虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-18 18:59:32:
3.6kb并不大,应该不难。
我觉得变性和退火的时间短了点,我们实验室一般用95℃/30秒变性,55℃/45秒退火,我自己用的是95℃/20秒变性,55℃/30秒退火。上面说的是常用的条件,如果扩增不出来就降低退火温度,特 ...

我现在正在用别人的dNTP和buffer重新PCR,希望能P出来,结果再告诉你,但是我以前也是这个试剂,P1000多bp的就能P出来
3楼2012-01-18 21:05:55
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
lyta0(金币+5): ★★★很有帮助 2012-01-18 21:13:19
3.6kb并不大,应该不难。
我觉得变性和退火的时间短了点,我们实验室一般用95℃/30秒变性,55℃/45秒退火,我自己用的是95℃/20秒变性,55℃/30秒退火。上面说的是常用的条件,如果扩增不出来就降低退火温度,特异性不高就提高退火温度,一般都能做出来的。
Taq酶每分钟扩增1kb,延伸时间3分30秒感觉不够。虽然一般这样也能做出来,但是既然你没做出来,我建议延伸时间改成4分钟。
另外,试剂也可能出问题。你的试剂做其他PCR是否正常呢?
2楼2012-01-18 18:59:32
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lyta0 at 2012-01-18 21:05:55:
我现在正在用别人的dNTP和buffer重新PCR,希望能P出来,结果再告诉你,但是我以前也是这个试剂,P1000多bp的就能P出来

呵呵,我们是鼓励反馈的哦~
祝实验顺利哈
4楼2012-01-19 00:04:46
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lyta0

木虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-19 00:04:46:
呵呵,我们是鼓励反馈的哦~
祝实验顺利哈

bad news, 还是没有问题,证明不是试剂的问题,看来得改条件了
5楼2012-01-19 01:07:21
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