应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR扩增求助
351/4返回列表1234下一页
查看: 5461  |  回复: 34
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

lyta0

木虫 (小有名气)

[求助] 大片段PCR扩增求助

我要扩增一个片段为3623bp的DNA,条件如下：98℃1分钟，然后是四十个循环：98℃10秒，52℃10秒，68℃3分30秒，最后是68℃6分钟，扩了好几次都失败，求助各位高手
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖 实验求助

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-01-18 18:27:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
lyta0(金币+5): ★★★很有帮助 2012-01-18 21:13:19
3.6kb并不大，应该不难。
我觉得变性和退火的时间短了点，我们实验室一般用95℃/30秒变性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒变性，55℃/30秒退火。上面说的是常用的条件，如果扩增不出来就降低退火温度，特异性不高就提高退火温度，一般都能做出来的。
Taq酶每分钟扩增1kb，延伸时间3分30秒感觉不够。虽然一般这样也能做出来，但是既然你没做出来，我建议延伸时间改成4分钟。
另外，试剂也可能出问题。你的试剂做其他PCR是否正常呢？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2012-01-18 18:59:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bearjazz

木虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2012-01-19 18:13:20
这两天，我p了一个2700bp的片段，延伸时间7分钟，退火时间1分钟，效果不错，送华大测通，拼接结果

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下(2人) 回复此楼
沉闷科学的掘墓人
7楼2012-01-19 06:56:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鱼山听涛

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 分析得很有道理！ 2012-01-20 14:10:38
lyta0(金币+5): 2012-01-20 16:07:36
1、如果已知所扩序列，看一下GC含量。如果GC含量高就改用GC buffer。
2、普通Taq扩增3-4 kb条带没有问题，如果不放心，可以用Takara的LA Taq。
3、解链和退火时间延长到30 sec。
4、Taq系列的扩增速度是2 kb/min，所以你用3.5 min延伸没有问题，循环数改为30即可，过多没有用处。
5、退火温度应该根据引物确定，一般为引物Tm减去5到10度。你没有批出来，可以考虑降低退火温度。
6、引物量是否够？有引物带吗？如果没有，增加引物用量。
7、模板量是否够？
赞一下(2人) 回复此楼
书到用时方恨少
14楼2012-01-20 09:31:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-18 18:59:32:
3.6kb并不大，应该不难。
我觉得变性和退火的时间短了点，我们实验室一般用95℃/30秒变性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒变性，55℃/30秒退火。上面说的是常用的条件，如果扩增不出来就降低退火温度，特 ...

我现在正在用别人的dNTP和buffer重新PCR,希望能P出来，结果再告诉你，但是我以前也是这个试剂，P1000多bp的就能P出来
赞一下 回复此楼
3楼2012-01-18 21:05:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lyta0 at 2012-01-18 21:05:55:
我现在正在用别人的dNTP和buffer重新PCR,希望能P出来，结果再告诉你，但是我以前也是这个试剂，P1000多bp的就能P出来

呵呵，我们是鼓励反馈的哦~
祝实验顺利哈
赞一下 回复此楼
4楼2012-01-19 00:04:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-19 00:04:46:
呵呵，我们是鼓励反馈的哦~
祝实验顺利哈

bad news, 还是没有问题，证明不是试剂的问题，看来得改条件了
赞一下 回复此楼
5楼2012-01-19 01:07:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cnliu51

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励交流~春节快乐哦~ 2012-01-20 14:09:55
稍长一点的片段，建议用TAKARA的LaTaq。我们用这种酶批出过2万bp的片段（两步法），对于3千多的片段，3步法没问题（我前不久用3步法批出过6千多的片段）。关于PCR程序，再大的片段，变性用94度20秒也足够了，除非片段中含有高比例GC，对于这种情况，我们一般用TAKARA的高GC含量BUFFER.
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2012-01-19 06:44:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

缘何

新虫 (初入文坛)
★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2012-01-19 18:13:37
可以试着加入甘油和DMSO，可代替GC buffer，对长片段扩增尤其是GC含量高的效果很好。 另外ＰＣＲ条件用梯度温度试一下。
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2012-01-19 10:49:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): Good！ 2012-01-19 18:13:55
感觉你这有点问题，我们这PCR P3000  4000 什么的各种没压力啊，还是你的酶不给力啊，我们扩质粒环改点扩4000的太正常了，载体就3000了 随意一个片段也超过1000啊 建议换酶 实际上TAKARA 的LA TAQ 也一般 只是比他们普通的酶保证性高一些，建议用PFU，不知道你是什么模板
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2012-01-19 12:10:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 393658000 at 2012-01-19 12:10:49:
感觉你这有点问题，我们这PCR P3000  4000 什么的各种没压力啊，还是你的酶不给力啊，我们扩质粒环改点扩4000的太正常了，载体就3000了 随意一个片段也超过1000啊 建议换酶 实际上TAKARA 的LA TAQ 也一般 只是比他 ...

用的模板是cDNA,酶是Phusion High-Fidelity DNA Polymerase
赞一下 回复此楼
10楼2012-01-19 16:29:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lyta0 的主题更新
351/4返回列表1234下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 269求调剂 +11 啊啊我我 2026-04-07 11/550 2026-04-11 16:45 by vgtyfty
[考研] 366求调剂 +7 不知名的小卅 2026-04-11 7/350 2026-04-11 16:45 by PeggyPeng17
[考研] 285求调剂 +8 恶法大二的气味� 2026-04-05 11/550 2026-04-11 11:28 by 紫曦紫棋
[考研] 一志愿哈工大 085600 277 12材科基求调剂 5+5 chenny174 2026-04-10 23/1150 2026-04-11 10:43 by Delta2012
[考研] 化学工程调剂289 +43 yang婷 2026-04-07 49/2450 2026-04-11 10:37 by 紫曦紫棋
[考研] 电气专硕320求调剂 +4 小麻子111 2026-04-10 4/200 2026-04-11 10:16 by Delta2012
[考研] 362求调剂 +10 我要考大 2026-04-06 14/700 2026-04-10 17:00 by luoyongfeng
[考研] 一志愿沪9，326生物学求相关专业调剂 +4 刘墨墨 2026-04-09 4/200 2026-04-10 12:07 by pengliang8036
[考研] 297求调剂 +27 GENJIOW 2026-04-07 30/1500 2026-04-09 23:20 by wolf97
[考研] 调剂 +19 2261744733 2026-04-08 19/950 2026-04-09 19:11 by vgtyfty
[考研] 求调剂 +3 猪肉墩粉条cc 2026-04-08 4/200 2026-04-09 10:05 by 猪肉墩粉条cc
[考研] 307求调剂 +14 超级伊昂大王 2026-04-06 14/700 2026-04-08 07:03 by 无际的草原
[考研] 一志愿西南090202求调剂 +4 在线求有学上 2026-04-07 4/200 2026-04-07 19:47 by biomichael
[考研] 085602调剂 初试总分335 +3 19123253302 2026-04-06 3/150 2026-04-07 18:00 by jp9609
[考研] 081200-11408-367学硕求调剂 +4 1_2_3111 2026-04-06 4/200 2026-04-07 08:13 by jp9609
[考研] 生物学学硕求调剂：351分一志愿南京师范大学生物学专业 +6 …～、王…～ 2026-04-06 7/350 2026-04-06 18:54 by macy2011
[考研] 22408 331分求调剂 +4 y__1 2026-04-06 4/200 2026-04-06 17:26 by 土木硕士招生
[考研] 283求调剂 +5 baiiyu 2026-04-05 6/300 2026-04-05 20:35 by 啵啵啵0119
[考研] 一志愿青科085500，初试295分，公共课213分 +3 遇到的人愿望都� 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:45 by 蓝云思雨
[考研] 考研调剂生寻找导师 +3 顾瞻考研啊 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:18 by 啵啵啵0119
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭