应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR扩增求助
353/4返回列表上一页1234下一页
查看: 5994  |  回复: 34
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

chenglong_li

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流~欢迎常来哈~ 2012-04-02 14:28:46
问题一样啊，3kb多的片段，扩了一个月，也没有好的电泳结果。
我分析或许与所扩增的基因有关系，其高级结果比较复杂，变性时间短的话解链不充分，变性时间长的话造成模板损伤，退火温度高的话引物与模板结合不充分，退火温度低的话造成非特异性条带，延伸过程rTaq酶每分钟1kb。
一些见解，供交流！
赞一下 回复此楼
21楼2012-04-02 10:20:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenglong_li

铁杆木虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-04-03 15:00:15
引用回帖:
21楼: Originally posted by chenglong_li at 2012-04-02 10:20:51:
问题一样啊，3kb多的片段，扩了一个月，也没有好的电泳结果。
我分析或许与所扩增的基因有关系，其高级结果比较复杂，变性时间短的话解链不充分，变性时间长的话造成模板损伤，退火温度高的话引物与模板结合不充 ...

昨天上午看了大家发的帖，晚上我就p出来了！
Thank all of you very much!
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

西瓜
22楼2012-04-03 08:11:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
送鲜花一朵
引用回帖:
22楼: Originally posted by chenglong_li at 2012-04-03 08:11:53:
昨天上午看了大家发的帖，晚上我就p出来了！
Thank all of you very much!

呵呵,恭喜恭喜~具体做了什么改进呢?
赞一下 回复此楼
23楼2012-04-03 15:01:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenglong_li

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小丹木木: 回帖置顶 2012-04-05 13:43:12
小丹木木: 金币+2, 很有帮助 2012-04-05 13:44:55
模板：我用“细菌基因组DNA提取试剂盒”进行了纯化;
Taq酶：换用了TaKaRa的Premix Taq Version 2.0(Loading dye mix);
反应：变性时间从1min减为30sec;
希望对大家有所帮助！
再次感谢大家！Thank you!
赞一下 回复此楼
24楼2012-04-05 12:49:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenglong_li

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by chenglong_li at 2012-04-05 12:49:25:
模板：我用“细菌基因组DNA提取试剂盒”进行了纯化;
Taq酶：换用了TaKaRa的Premix Taq Version 2.0(Loading dye mix);
反应：变性时间从1min减为30sec;
希望对大家有所帮助！
再次感谢大家！Thank you!

还有，
反应：退火时间为1min
赞一下 回复此楼
25楼2012-04-05 12:53:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三撇五撇

银虫 (小有名气)
从头看到尾 好像都是有模版 然后进行扩增
那么在此可以分析一下了。
1，模版的浓度不要太高20-60ng/ul足矣 吸取1ul为模板
2，首位引物的量够么 跑电泳时有明显亮带么？没有就多加点 一般我各加1ul
3，buffer 和 taq 保证其都是ok的 注意使用量
4，看GC含量含量高对应的复性温度就高一些 GC含量达到65%以上 我都是会考虑添加DMSO的
5，我的程序 预变性95 3min 变性98 12s 复性 40-64 根据GC含量 延伸 1min1000bp计算 最后延伸 5min 2步——4步 22循环 就好了
赞一下 回复此楼
26楼2012-09-20 23:49:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三撇五撇

银虫 (小有名气)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2012-09-20 23:49:01
从头看到尾 好像都是有模版 然后进行扩增
那么在此可以分析一下了。
1，模版的浓度不要太高20-60ng/ul足矣 吸取1ul为模板
2，首位引物的量够么 跑电泳时有明显亮带么？没有就多加点 一般我各加1ul
3，buffer 和 ...

忘记说了 一般退火时间都是20s
赞一下 回复此楼
27楼2012-09-20 23:50:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Annie-lq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2012-09-20 23:49:01
从头看到尾 好像都是有模版 然后进行扩增
那么在此可以分析一下了。
1，模版的浓度不要太高20-60ng/ul足矣 吸取1ul为模板
2，首位引物的量够么 跑电泳时有明显亮带么？没有就多加点 一般我各加1ul
3，buffer 和 ...

我也用cDNA扩1209bp的目的带，我的目的带GC 含量较高为68%，两个引物的Tm分别是56度和70度，我在这两个温度间做了温度梯度，结果有3个温度扩出来了，但是扩出来的带只有500bp，我的引物设计时引入了两个酶切位点，但是我的目的带在500bp左右有一个酶切位点，有没有可能是这个原因扩出来的带是500bp啊？
赞一下 回复此楼
28楼2013-03-26 09:32:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三撇五撇

银虫 (小有名气)
???????:
28?: Originally posted by Annie-lq at 2013-03-26 09:32:17
?????cDNA??1209bp???????????????GC ????????68%???????????Tm?????56???70?????????????????????????????????3??????????????????????????????500bp??????????????????????????λ?? ...

扩PCR和酶切??点没关系  你这个情况我???到过 直接梯度?? 或者梯度???的方法???扩
赞一下 回复此楼
29楼2013-03-28 20:17:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cwpyml2007

新虫 (初入文坛)
我p的是6000bp片段（LA系），pcr条件如下：
     模板:1                94°-5min  94-1min  58-1min  72-2min  72-10min  35个循环
     buffer:2
     dntp:2
     LA酶：0.2
    引物：2
    ddH2O:12.8
   结果：非特异性条带多，均不是目的条带（小于6000） ，求解！！！
赞一下 回复此楼
30楼2013-05-20 14:36:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lyta0 的主题更新
353/4返回列表上一页1234下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +55 医学老男孩 2026-08-13 123/6150 2026-08-19 23:44 by stan_et
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +13 kkkl_v 2026-08-19 13/650 2026-08-19 22:37 by 宝贝虫子
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +10 yuleib84 2026-08-18 11/550 2026-08-19 07:30 by 羽毛枫f
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +13 Ldrop2023 2026-08-13 16/800 2026-08-18 12:25 by 淀粉搬运工
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭