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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR扩增求助
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chenglong_li

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流~欢迎常来哈~ 2012-04-02 14:28:46
问题一样啊，3kb多的片段，扩了一个月，也没有好的电泳结果。
我分析或许与所扩增的基因有关系，其高级结果比较复杂，变性时间短的话解链不充分，变性时间长的话造成模板损伤，退火温度高的话引物与模板结合不充分，退火温度低的话造成非特异性条带，延伸过程rTaq酶每分钟1kb。
一些见解，供交流！
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21楼2012-04-02 10:20:51
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chenglong_li

铁杆木虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-04-03 15:00:15
引用回帖:
21楼: Originally posted by chenglong_li at 2012-04-02 10:20:51:
问题一样啊，3kb多的片段，扩了一个月，也没有好的电泳结果。
我分析或许与所扩增的基因有关系，其高级结果比较复杂，变性时间短的话解链不充分，变性时间长的话造成模板损伤，退火温度高的话引物与模板结合不充 ...

昨天上午看了大家发的帖，晚上我就p出来了！
Thank all of you very much!
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

西瓜
22楼2012-04-03 08:11:53
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
送鲜花一朵
引用回帖:
22楼: Originally posted by chenglong_li at 2012-04-03 08:11:53:
昨天上午看了大家发的帖，晚上我就p出来了！
Thank all of you very much!

呵呵,恭喜恭喜~具体做了什么改进呢?
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23楼2012-04-03 15:01:05
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chenglong_li

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小丹木木: 回帖置顶 2012-04-05 13:43:12
小丹木木: 金币+2, 很有帮助 2012-04-05 13:44:55
模板：我用“细菌基因组DNA提取试剂盒”进行了纯化;
Taq酶：换用了TaKaRa的Premix Taq Version 2.0(Loading dye mix);
反应：变性时间从1min减为30sec;
希望对大家有所帮助！
再次感谢大家！Thank you!
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24楼2012-04-05 12:49:25
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chenglong_li

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by chenglong_li at 2012-04-05 12:49:25:
模板：我用“细菌基因组DNA提取试剂盒”进行了纯化;
Taq酶：换用了TaKaRa的Premix Taq Version 2.0(Loading dye mix);
反应：变性时间从1min减为30sec;
希望对大家有所帮助！
再次感谢大家！Thank you!

还有，
反应：退火时间为1min
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25楼2012-04-05 12:53:19
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三撇五撇

银虫 (小有名气)
从头看到尾 好像都是有模版 然后进行扩增
那么在此可以分析一下了。
1，模版的浓度不要太高20-60ng/ul足矣 吸取1ul为模板
2，首位引物的量够么 跑电泳时有明显亮带么？没有就多加点 一般我各加1ul
3，buffer 和 taq 保证其都是ok的 注意使用量
4，看GC含量含量高对应的复性温度就高一些 GC含量达到65%以上 我都是会考虑添加DMSO的
5，我的程序 预变性95 3min 变性98 12s 复性 40-64 根据GC含量 延伸 1min1000bp计算 最后延伸 5min 2步——4步 22循环 就好了
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26楼2012-09-20 23:49:01
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三撇五撇

银虫 (小有名气)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2012-09-20 23:49:01
从头看到尾 好像都是有模版 然后进行扩增
那么在此可以分析一下了。
1，模版的浓度不要太高20-60ng/ul足矣 吸取1ul为模板
2，首位引物的量够么 跑电泳时有明显亮带么？没有就多加点 一般我各加1ul
3，buffer 和 ...

忘记说了 一般退火时间都是20s
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27楼2012-09-20 23:50:08
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Annie-lq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2012-09-20 23:49:01
从头看到尾 好像都是有模版 然后进行扩增
那么在此可以分析一下了。
1，模版的浓度不要太高20-60ng/ul足矣 吸取1ul为模板
2，首位引物的量够么 跑电泳时有明显亮带么？没有就多加点 一般我各加1ul
3，buffer 和 ...

我也用cDNA扩1209bp的目的带，我的目的带GC 含量较高为68%，两个引物的Tm分别是56度和70度，我在这两个温度间做了温度梯度，结果有3个温度扩出来了，但是扩出来的带只有500bp，我的引物设计时引入了两个酶切位点，但是我的目的带在500bp左右有一个酶切位点，有没有可能是这个原因扩出来的带是500bp啊？
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28楼2013-03-26 09:32:17
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三撇五撇

银虫 (小有名气)
???????:
28?: Originally posted by Annie-lq at 2013-03-26 09:32:17
?????cDNA??1209bp???????????????GC ????????68%???????????Tm?????56???70?????????????????????????????????3??????????????????????????????500bp??????????????????????????λ?? ...

扩PCR和酶切??点没关系  你这个情况我???到过 直接梯度?? 或者梯度???的方法???扩
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29楼2013-03-28 20:17:19
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cwpyml2007

新虫 (初入文坛)
我p的是6000bp片段（LA系），pcr条件如下：
     模板:1                94°-5min  94-1min  58-1min  72-2min  72-10min  35个循环
     buffer:2
     dntp:2
     LA酶：0.2
    引物：2
    ddH2O:12.8
   结果：非特异性条带多，均不是目的条带（小于6000） ，求解！！！
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30楼2013-05-20 14:36:32
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