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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR扩增求助
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lyta0

木虫 (小有名气)

[求助] 大片段PCR扩增求助

我要扩增一个片段为3623bp的DNA,条件如下：98℃1分钟，然后是四十个循环：98℃10秒，52℃10秒，68℃3分30秒，最后是68℃6分钟，扩了好几次都失败，求助各位高手
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1楼 2012-01-18 18:27:09
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Annie-lq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2012-09-20 23:49:01
从头看到尾 好像都是有模版 然后进行扩增
那么在此可以分析一下了。
1，模版的浓度不要太高20-60ng/ul足矣 吸取1ul为模板
2，首位引物的量够么 跑电泳时有明显亮带么？没有就多加点 一般我各加1ul
3，buffer 和 ...

我也用cDNA扩1209bp的目的带，我的目的带GC 含量较高为68%，两个引物的Tm分别是56度和70度，我在这两个温度间做了温度梯度，结果有3个温度扩出来了，但是扩出来的带只有500bp，我的引物设计时引入了两个酶切位点，但是我的目的带在500bp左右有一个酶切位点，有没有可能是这个原因扩出来的带是500bp啊？
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28楼2013-03-26 09:32:17
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
lyta0(金币+5): ★★★很有帮助 2012-01-18 21:13:19
3.6kb并不大，应该不难。
我觉得变性和退火的时间短了点，我们实验室一般用95℃/30秒变性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒变性，55℃/30秒退火。上面说的是常用的条件，如果扩增不出来就降低退火温度，特异性不高就提高退火温度，一般都能做出来的。
Taq酶每分钟扩增1kb，延伸时间3分30秒感觉不够。虽然一般这样也能做出来，但是既然你没做出来，我建议延伸时间改成4分钟。
另外，试剂也可能出问题。你的试剂做其他PCR是否正常呢？
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2楼2012-01-18 18:59:32
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lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-18 18:59:32:
3.6kb并不大，应该不难。
我觉得变性和退火的时间短了点，我们实验室一般用95℃/30秒变性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒变性，55℃/30秒退火。上面说的是常用的条件，如果扩增不出来就降低退火温度，特 ...

我现在正在用别人的dNTP和buffer重新PCR,希望能P出来，结果再告诉你，但是我以前也是这个试剂，P1000多bp的就能P出来
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3楼2012-01-18 21:05:55
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lyta0 at 2012-01-18 21:05:55:
我现在正在用别人的dNTP和buffer重新PCR,希望能P出来，结果再告诉你，但是我以前也是这个试剂，P1000多bp的就能P出来

呵呵，我们是鼓励反馈的哦~
祝实验顺利哈
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4楼2012-01-19 00:04:46
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