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新虫 (初入文坛)

最近开始做long-PCR,看了上述大家的帖子,受益非深。我觉得扩增不理想原因,除了反应条件问题,主要的原因还是引物问题吧。
31楼2013-11-29 09:29:20
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小橘子2013

新虫 (小有名气)

引用回帖:
28楼: Originally posted by Annie-lq at 2013-03-26 09:32:17
我也用cDNA扩1209bp的目的带,我的目的带GC 含量较高为68%,两个引物的Tm分别是56度和70度,我在这两个温度间做了温度梯度,结果有3个温度扩出来了,但是扩出来的带只有500bp,我的引物设计时引入了两个酶切位点, ...

我得情况跟你差不多,请问你的扩出来了吗?求交流。。
简简单单才是真
32楼2014-03-25 16:28:52
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求:
1.用Taq-LA DNA聚合酶,该酶是Taq酶或Klentaq 1(无纠错功能)与pfu酶或Deep Vent酶(有纠错功能)的混合物,以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时,需要加入高浓度的甜茶碱(终浓度为1.5-2.0mol/L),提高PCR的效率,但是甜茶碱加入后,要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度,不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短,尤其是一般不超过30 s,尤其是模板长度超过8KD时更是如此,变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度,同时加长延伸反应时间,长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟,长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟,楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为:500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵,25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物(25-30 bp)。

我今天的回答比过去的同类问题的回答要简便,应该更容易操作一些。
33楼2014-07-08 02:01:30
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Neo2000

木虫 (著名写手)

引物设计的温度太低了吧,变性温度降下来,95差不多了,不要信所谓的超保真,温度高,半衰期短。

[ 发自小木虫客户端 ]
34楼2014-07-08 12:30:43
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hsis

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 鱼山听涛 at 2012-01-20 09:31:56
1、如果已知所扩序列,看一下GC含量。如果GC含量高就改用GC buffer。
2、普通Taq扩增3-4 kb条带没有问题,如果不放心,可以用Takara的LA Taq。
3、解链和退火时间延长到30 sec。
4、Taq系列的扩增速度是2 kb/min ...

请问你P出来所用的条件是?
35楼2015-09-10 10:22:02
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