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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR扩增求助
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hospitals

新虫 (初入文坛)
最近开始做long-PCR，看了上述大家的帖子，受益非深。我觉得扩增不理想原因，除了反应条件问题，主要的原因还是引物问题吧。
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31楼2013-11-29 09:29:20
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小橘子2013

新虫 (小有名气)
引用回帖:
28楼: Originally posted by Annie-lq at 2013-03-26 09:32:17
我也用cDNA扩1209bp的目的带，我的目的带GC 含量较高为68%，两个引物的Tm分别是56度和70度，我在这两个温度间做了温度梯度，结果有3个温度扩出来了，但是扩出来的带只有500bp，我的引物设计时引入了两个酶切位点， ...

我得情况跟你差不多，请问你的扩出来了吗？求交流。。
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简简单单才是真
32楼2014-03-25 16:28:52
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求：
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)。

我今天的回答比过去的同类问题的回答要简便，应该更容易操作一些。
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33楼2014-07-08 02:01:30
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Neo2000

木虫 (著名写手)
引物设计的温度太低了吧，变性温度降下来，95差不多了，不要信所谓的超保真，温度高，半衰期短。

[ 发自小木虫客户端 ]
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34楼2014-07-08 12:30:43
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hsis

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 鱼山听涛 at 2012-01-20 09:31:56
1、如果已知所扩序列，看一下GC含量。如果GC含量高就改用GC buffer。
2、普通Taq扩增3-4 kb条带没有问题，如果不放心，可以用Takara的LA Taq。
3、解链和退火时间延长到30 sec。
4、Taq系列的扩增速度是2 kb/min ...

请问你P出来所用的条件是？
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35楼2015-09-10 10:22:02
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