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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR扩增求助
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lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-18 18:59:32:
3.6kb并不大，应该不难。
我觉得变性和退火的时间短了点，我们实验室一般用95℃/30秒变性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒变性，55℃/30秒退火。上面说的是常用的条件，如果扩增不出来就降低退火温度，特 ...

按照你的条件也没有P出来，我想是不是酶的原因
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11楼2012-01-19 16:53:08
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lyta0 at 2012-01-19 16:53:08:
按照你的条件也没有P出来，我想是不是酶的原因

把能换的都换换吧……要不就找别人帮你试试，有时候就是这么莫名其妙
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12楼2012-01-19 18:14:36
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lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-19 18:14:36:
把能换的都换换吧……要不就找别人帮你试试，有时候就是这么莫名其妙

是啊，运气也是一方面，谢谢啦
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13楼2012-01-19 18:33:09
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鱼山听涛

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 分析得很有道理！ 2012-01-20 14:10:38
lyta0(金币+5): 2012-01-20 16:07:36
1、如果已知所扩序列，看一下GC含量。如果GC含量高就改用GC buffer。
2、普通Taq扩增3-4 kb条带没有问题，如果不放心，可以用Takara的LA Taq。
3、解链和退火时间延长到30 sec。
4、Taq系列的扩增速度是2 kb/min，所以你用3.5 min延伸没有问题，循环数改为30即可，过多没有用处。
5、退火温度应该根据引物确定，一般为引物Tm减去5到10度。你没有批出来，可以考虑降低退火温度。
6、引物量是否够？有引物带吗？如果没有，增加引物用量。
7、模板量是否够？
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书到用时方恨少
14楼2012-01-20 09:31:56
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lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 鱼山听涛 at 2012-01-20 09:31:56:
1、如果已知所扩序列，看一下GC含量。如果GC含量高就改用GC buffer。
2、普通Taq扩增3-4 kb条带没有问题，如果不放心，可以用Takara的LA Taq。
3、解链和退火时间延长到30 sec。
4、Taq系列的扩增速度是2 kb/m ...

跑出来的都是引物二聚体，引物应该够用，模板是0.5微升，问题也不大
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15楼2012-01-20 16:07:31
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shuishui007

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励应助！ 2012-01-21 18:38:08
长片段cDNA扩增时，可用RNaseH去掉RNA。另外要确信其中有目标基因，因生物材料某一基因的表达可能不是组成性质的，这样就存在时空限制，根据文献资料确定提取的mRNA含有目标基因，或者在3’端设计引物，先常规扩增300－500bp的目标基因片段，检测目标基因的存在。实在不能一次性扩增时，就分段扩增，进行SOE吧。
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16楼2012-01-21 11:23:18
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绍兴

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lyta0 at 2012-01-19 01:07:21:
bad news, 还是没有问题，证明不是试剂的问题，看来得改条件了

您好  可以交流下吗？ 我要扩的片段是9k，用的是KOD酶，但是现在扩不出来，希望您不吝赐教
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17楼2012-03-08 16:14:40
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绍兴

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by shuishui007 at 2012-01-21 11:23:18:
长片段cDNA扩增时，可用RNaseH去掉RNA。另外要确信其中有目标基因，因生物材料某一基因的表达可能不是组成性质的，这样就存在时空限制，根据文献资料确定提取的mRNA含有目标基因，或者在3’端设计引物，先常规扩增 ...

您好  可以交流下吗？ 我要扩的片段是9k，用的是KOD酶，但是现在扩不出来，希望您不吝赐教
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18楼2012-03-08 16:15:43
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)
哪位高手能帮我解答一下啊：我有一个3336bp的片段，做了好多次PCR了，试过梯度PCR，条件为：第一步：95℃ 5 min，第二步：95℃ 30s ，第三步：温度梯度为（48-52℃）1min，第四步：72℃ 4min，第二道第四步共30个循环，第五步72℃ 10min，条带呈弥散状
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硕士毕业去找工作
19楼2012-03-10 21:59:49
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)
西瓜: 可以另外发个帖哦 2012-03-14 22:16:48
        大片段扩增求解答哪位高手能帮我解答一下啊：我有一个3336bp的片段，做了好多次PCR了，试过梯度PCR，条件为：第一步：95℃ 5 min，第二步：95℃ 30s ，第三步：温度梯度为（48-52℃）1min，第四步：72℃ 4min，第二到第四步共30个循环，第五步72℃ 10min，条带呈弥散状
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硕士毕业去找工作
20楼2012-03-14 21:50:55
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