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[求助]
大片段PCR扩增求助
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| 我要扩增一个片段为3623bp的DNA,条件如下：98℃1分钟，然后是四十个循环：98℃10秒，52℃10秒，68℃3分30秒，最后是68℃6分钟，扩了好几次都失败，求助各位高手 |
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 【分子生物】EPI帖 | 实验求助 |
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 分析得很有道理！ 2012-01-20 14:10:38
lyta0(金币+5): 2012-01-20 16:07:36
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 分析得很有道理！ 2012-01-20 14:10:38
lyta0(金币+5): 2012-01-20 16:07:36
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1、如果已知所扩序列，看一下GC含量。如果GC含量高就改用GC buffer。 2、普通Taq扩增3-4 kb条带没有问题，如果不放心，可以用Takara的LA Taq。 3、解链和退火时间延长到30 sec。 4、Taq系列的扩增速度是2 kb/min，所以你用3.5 min延伸没有问题，循环数改为30即可，过多没有用处。 5、退火温度应该根据引物确定，一般为引物Tm减去5到10度。你没有批出来，可以考虑降低退火温度。 6、引物量是否够？有引物带吗？如果没有，增加引物用量。 7、模板量是否够？ |
14楼2012-01-20 09:31:56