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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 鼠基因组的PCR扩增
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317186304

银虫 (小有名气)

[求助] 鼠基因组的PCR扩增

一直在PCR扩增小鼠的基因组，引物设计了四对， 一直没有扩出来，求助呀？？
目的片段长度为900左右。有时候用15ul的体系能扩增出来，但是扩大到50ul就扩不出来了。而且现在用相同的体系竟然又扩不出来了？？？
我在目的片段的下游成功的扩增出来了一段900bp的片段，但用相同的体系和反应条件一直扩不出来。而且扩出来的那次条带很弱，不能回收 求助呀
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1楼 2013-04-03 19:39:12
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 鼓励应助，分子生物期待你的精彩。 2013-04-05 13:00:48
你用什么酶扩增的，以基因组为模板扩启动子，建议使用taq酶，而不是使用PFU等高保真酶，pfu等高保真很容易扩不出来，用Taq酶虽然有时会有突变，但多测几个克隆也是能筛选到的
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-04-04 13:38:06
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317186304

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-04 13:38:06
你用什么酶扩增的，以基因组为模板扩启动子，建议使用taq酶，而不是使用PFU等高保真酶，pfu等高保真很容易扩不出来，用Taq酶虽然有时会有突变，但多测几个克隆也是能筛选到的

我用的的Invitrogen的Platinum supermix, 用的是Ta酶。一直用的都是Taq酶
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3楼2013-04-04 19:25:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-04-05 13:16:28
可能是模板的问题。反复冻融对基因组DNA的损伤还是很大的，试试稍微增加一些模板量P。
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4楼2013-04-05 01:00:18
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宋虫虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-04-05 13:16:15
15ul的体系浓度能达到扩增的效果，说明实验体系中各方面的因素都在可控之内，之后你又用15ul体系来扩增反而扩不出来，这时候你就要分析一下的实验各方面有没有出现于之前不同的因素找出原因所在（比如：模板、引物。底物浓度）。实验时不要随便改变反应体系改了一项，其他的底物浓度都要更改，变量因素更多，不如在一个体系中不断优化，再进行体系的更改效果会更好。
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让自己变得更强
5楼2013-04-05 12:36:50
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