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knighteva

禁虫 (初入文坛)

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cute_man

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


knighteva: 金币+1, 有帮助 2013-05-09 09:35:32
如果我没猜错,你应该克隆的是真核生物的基因,cDNA和基因组DNA相比缺少了内含子片段,我这边有个同学也遇到了这种情况,我觉得可能还是引物问题,以cDNA设计的引物在基因组DNA上扩增,可能引物正好搭在内含子片段上,那肯定影响退火,建议多设几段引物,只要扩增出目的片段,不管长短,就可以想其他办法再拿到基因组上的全长
9楼2013-05-08 09:56:50
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, good 2012-04-25 13:30:44
设计引物回来Tm值是多少,一般都以那个为参考,退火温度比Tm值低5-15度。但是像你说的,不同温度都有很多条带的话, 可能是你引物设计的不好,特异性差。我以前遇到过这种状况,后来重新设计一对引物就好了。
未来不是梦
2楼2012-04-24 19:28:01
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changes

木虫 (正式写手)

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-25 13:31:08
这个许多人都遇到过,我也碰到过。简单分析一下:
1.你的基因组DNA质量怎么样?提取多久了?浓度大约多少?
2.材料是二倍体的还是多倍体的?同源材料、异源材料?
3.ORF多大的片段?可以选择的引物位点多吗?
4.PCR时换一个适合高GC含量的Taq酶试试,或者利用Pfu Taq酶。
5.Tm值可能尚需摸索
6.以上方法都试过了还不行的话,就换一下引物吧。(可以结合同源基因或同一类的基因的基因组序列)
3楼2012-04-24 20:38:47
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
很有可能是你的引物特异性不够,这种事情是很常见的,你可以把你的引物和整个基因组序列做一下序列对比或者BLAST一下,可以找找是不是这个原因。
还有就是适当提高退火温度,提高引物特异性,呵呵,都可以试试了,祝顺利。
4楼2012-04-25 13:34:19
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