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hihe99

银虫 (小有名气)

[求助] race pcr问题,没有特异性条带

生手做race,5'时两次扩增,跑出来的图没有特异性产物,巢氏扩增的第二次结果更是奇怪,都从胶孔开始弥散了,求前辈们指点
图中,1,2,3是第一次扩增,3是阴性对照
4~8是第二次扩增,8是阴性对照,4,6模板分别是1,2;5,7模板是稀释20倍的1,2
race pcr问题,没有特异性条带
1.jpg
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grape_vine

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by hihe99 at 2013-09-04 14:00:04
另外,后面的我感觉有产物生成,但是产物从胶孔往下弥散,大概是什么原因呢...

这个说的太悬乎了.不清楚啥情况.
6楼2013-09-04 15:59:49
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查看全部 8 个回答

hihe99

银虫 (小有名气)

求助啊,大神们帮忙啊
2楼2013-09-03 19:42:37
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-04 15:22:40
hihe99: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-09-05 14:40:44
首先建议你用试剂盒自带的验证系统看看是不是整个系统工作正常.因为你没说用的是什么试剂盒,不同的试剂盒效率也不近相同,碰到问题的时候验证一下系统会比较有信心.3''RACE好做,但是5'RACE对扩增用的taq酶要求也很高,你要确保系统每一部分工作都正常.
其次要看看反转录本身有没有问题.可以拿个长点的基因来验证一下.
再次是不是你设计的引物不是太合适作RACE? 或者说你设计的退货温度比较低而实际用的退货温度比较高?如果有3'引物,并且和5'的引物有overlap, 可以扩增一下,看看引物是否可用,反转录是否成功.
3楼2013-09-04 08:14:02
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hihe99

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by grape_vine at 2013-09-04 09:14:02
首先建议你用试剂盒自带的验证系统看看是不是整个系统工作正常.因为你没说用的是什么试剂盒,不同的试剂盒效率也不近相同,碰到问题的时候验证一下系统会比较有信心.3''RACE好做,但是5'RACE对扩增用的taq酶要求也很高 ...

终于有回复了,谢谢!
我没有用专门的试剂盒,参考1篇文章做的,3'能扩出来,但是带总是很弱,请问是什么原因啊,
按你的建议,我先验证下反转录吧
谢谢!
4楼2013-09-04 13:49:07
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