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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RACE实验中的 GC-Rich 问题
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libing198968

银虫 (初入文坛)

[求助] RACE实验中的 GC-Rich 问题

大家好，我刚开始做RACE的新兵，我用的是Clontech的SMARTer™ RACE  cDNA Amplification Kit。说明书上提示说GC含量过高，不能得到预期产物，就要用Clontech 提供Advantage GC 2 Polymerase Mix (Cat. No. 639114) and PCR Kit (Cat. Nos. 639119 &639120) 来有效扩增 GC-rich模板。
我想问一下，对于植物而言，GC含量多少以上就算是GC含量过高呢？
还有就是假设预期的GC含量比较高，但真实的GC含量没有那么高，用Advantage GC 2 Polymerase Mix 来扩增会不会更加影响扩增效率呢？
求大侠指点
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生活没有彩排，所以任何时候都要好好表现，因为你没有再来一次
1楼 2011-07-19 16:33:09
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taigongzaici

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-07-20 16:29:58
libing198968(金币+2): 谢谢，大家都这么说，可能我用对照RNA都没P出来目的条带，不知道是不是酶的原因，我用的是takara的Taq酶 2011-07-21 11:18:23
Clontech的SMARTer™ RACE  cDNA Amplification Kit很好用，大胆做，按照试剂盒要求，没问题，前提是RNA要过关
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2楼2011-07-20 09:44:04
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

楼上说的有道理，关键是RNA质量要过关！
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jiayoubashaonian
3楼2011-07-20 09:55:58
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libing198968

银虫 (初入文坛)
我用的是Takara的聚合酶，做了一次对照PCR没有跑出目的条带，是不是一定要用说明书中的Advantage 2 Polymerase Mix试剂盒呢
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生活没有彩排，所以任何时候都要好好表现，因为你没有再来一次
4楼2011-07-20 16:14:55
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ycky2010

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-07-20 18:12:08
libing198968(金币+1): 2011-08-15 11:02:34
GC和AT之间是以氢键结合的，GC之间由3个氢键结合，AT之间由2个氢键结合.氢键越多越稳定，所以GC配对就相应难些。一般情况下，我们实验室GC含量为55%左右最好，做出来的可能性越大。GC含量不能过高或者过低
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5楼2011-07-20 17:31:31
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
libing198968(金币+5): 非常感谢 2011-07-21 11:18:57
西瓜(金币+3): Good！ 2011-07-21 11:45:36
libing198968(金币+2): 2011-08-15 11:02:38
GC含量在65%以上就是GC rich了，如果实际的GC含量没有预期的高，那么你采用做GC rich的盒子来做虽然降低了扩增效率但提高了特异性，理论上讲是这样，但如果引物的Tm值很低，那么过高的退化温度会让引物很难结合到模板上，有时候也得不到片段，所以做之前要认真分析一下再做
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
6楼2011-07-20 22:14:45
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guanzhow

木虫 (小有名气)
哪位大侠知道
SMARTer II A Oligonucleotide (12 μM)
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX–3'
(X = undisclosed base in the proprietary SMARTer oligo sequence)
X是哪些碱基， 可以用什么替代 ？
谢谢！
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7楼2011-09-27 12:33:23
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nmhsd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
1449539楼: Originally posted by guanzhow at 2011-09-27 12:33:23
哪位大侠知道
SMARTer II A Oligonucleotide (12 μM)
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX–3'
(X = undisclosed base in the proprietary SMARTer oligo sequence)
X是哪些碱基， 可以用什么替代 ？
谢谢！

可能吧，希望你征求更多人的意见，我没测过RACE产物的序列。XXXXX=GCGGG
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8楼2012-06-26 15:25:36
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nieqiantina

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by guanzhow at 2011-09-27 12:33:23
哪位大侠知道
SMARTer II A Oligonucleotide (12 μM)
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX–3'
(X = undisclosed base in the proprietary SMARTer oligo sequence)
X是哪些碱基， 可以用什么替代 ？
谢谢！

这个不用管，试剂盒里面已经是有的，是公司的秘密的东西，你是要自己做这个？
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9楼2014-04-17 11:41:34
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Neo2000

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by libing198968 at 2011-07-20 16:14:55
我用的是Takara的聚合酶，做了一次对照PCR没有跑出目的条带，是不是一定要用说明书中的Advantage 2 Polymerase Mix试剂盒呢

第一轮必须用这个，不然效果很难讲哦

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2014-04-17 12:29:35
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