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董庄青年

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大 已有7人参与

最近做PCR很郁闷  如图: 目的条带(上面  浅浅的)太弱     引物二聚体(下面)很亮  
PCR条件优化时要么带很浅  要么没有带   最后优化成下图所示  带一直很浅  求解   先谢谢各位!!!
引物是生工刚合成的    模板是新提的   带都很亮   
PCR体系(25ul):10×buffer: 2.5ul     dNTP-MIX(10mM): 0.5ul     引物(10um):各1.5ul        模板(4kb): 1ul(150ng左右)   Tap DNA Polymerase(5U/ul):  0.5 ul   水:17.5ul
PCR程序:94℃  5min; 94℃  1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃  10min;共20个循环::cat39

PCR目的条带太弱 并无非特异性条带  怎样改进可以使目的产物的量加大
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代德艳

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-16 15:59:23
30个循环也试过 基本没什么变化啊   晕闷...

这个引物也是以前用过的?
8楼2014-07-16 16:14:49
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查看全部 52 个回答

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
董庄青年: 金币+1 2014-07-16 12:08:46
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流! 2014-07-16 13:03:16
引物设计的不好,大部分引物都形成引物二聚体了,扩增效率肯定低,不放把引物序列传上,帮你分析一下引物的质量如何。
另外,扩增的目的条带是多大?延伸时间设置6 min,循环数20 cycles,感觉延伸时间太长,循环数偏少,可以设置到30-35 cycles。
如果你进行长片段扩增的话,有专门的长片段试剂盒,扩增效率很高的。
rainwater
2楼2014-07-16 11:35:14
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董庄青年

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好,大部分引物都形成引物二聚体了,扩增效率肯定低,不放把引物序列传上,帮你分析一下引物的质量如何。
另外,扩增的目的条带是多大?延伸时间设置6 min,循环数20 cycles,感觉延伸时间太长,循环数 ...

哦  我的引物是同源引物   形成二聚体是正常的  而且我的目的条带是4kd就是整个质粒的长度   以前能p出来  最近就是不行
3楼2014-07-16 12:22:21
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董庄青年

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好,大部分引物都形成引物二聚体了,扩增效率肯定低,不放把引物序列传上,帮你分析一下引物的质量如何。
另外,扩增的目的条带是多大?延伸时间设置6 min,循环数20 cycles,感觉延伸时间太长,循环数 ...

引物1:5’-GGAGTTGATGGTGCAGGAAATGAATTG-3’
引物2:5’-CAATTCATTTCCTGCACCATCAACTCC-3’
4楼2014-07-16 14:14:47
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