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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » V3区pcr出现非特异性条带怎么办？
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doubleping

新虫 (小有名气)

[求助] V3区pcr出现非特异性条带怎么办？

我用16S的pcr产物扩增V3区，目的片段在250bp左右，但是我扩增出来出现了四条很淡的非特异性条带，大小在1400-300bp之间，不明白这是为什么？给位大神给点意见吧！！！！
我使用体系是2*taq mastermix 15ul,引物 10um/ml  各1ul,模版1ul,ddH2O 12ul，总共30ul，程序是touchdownPCR程序，枪头和水、离心管都是高温灭菌过的，不过没有在超净台和冰上操作。
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1楼 2013-07-21 11:02:13
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-07-21 12:39:52
延伸时间和退火温度是多少？
试试减少一些引物和模版的量
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2楼2013-07-21 11:48:53
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久久季雨

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
能不能把图弄上来！也不一定是非特异性条带~
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我就是我！带不了假面具
3楼2013-07-21 11:58:58
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doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wubingqi at 2013-07-21 11:48:53
延伸时间和退火温度是多少？
试试减少一些引物和模版的量

我用的是touchdownPCR程序，65-55摄氏度，一分钟
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4楼2013-07-21 12:00:11
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doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 久久季雨 at 2013-07-21 11:58:58
能不能把图弄上来！也不一定是非特异性条带~

我的图是tif格式的，一直上传不了，请指点
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5楼2013-07-21 16:45:21
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by doubleping at 2013-07-21 12:00:11
我用的是touchdownPCR程序，65-55摄氏度，一分钟...

降落pcr没有问题，但是250bp延伸一分钟太长了，最多半分种足够了。我570bp才用40秒。
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6楼2013-07-22 09:30:45
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doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wubingqi at 2013-07-22 09:30:45
降落pcr没有问题，但是250bp延伸一分钟太长了，最多半分种足够了。我570bp才用40秒。...

嗯，谢谢，我再试试
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7楼2013-07-22 10:41:06
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