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doubleping

新虫 (小有名气)

[求助] V3区pcr出现非特异性条带怎么办?

我用16S的pcr产物扩增V3区,目的片段在250bp左右,但是我扩增出来出现了四条很淡的非特异性条带,大小在1400-300bp之间,不明白这是为什么?给位大神给点意见吧!!!!
我使用体系是2*taq mastermix 15ul,引物 10um/ml  各1ul,模版1ul,ddH2O 12ul,总共30ul,程序是touchdownPCR程序,枪头和水、离心管都是高温灭菌过的,不过没有在超净台和冰上操作。
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助! 2013-07-21 12:39:52
延伸时间和退火温度是多少?
试试减少一些引物和模版的量
2楼2013-07-21 11:48:53
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久久季雨

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
能不能把图弄上来!也不一定是非特异性条带~
我就是我!带不了假面具
3楼2013-07-21 11:58:58
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doubleping

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wubingqi at 2013-07-21 11:48:53
延伸时间和退火温度是多少?
试试减少一些引物和模版的量

我用的是touchdownPCR程序,65-55摄氏度,一分钟
4楼2013-07-21 12:00:11
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doubleping

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 久久季雨 at 2013-07-21 11:58:58
能不能把图弄上来!也不一定是非特异性条带~

我的图是tif格式的,一直上传不了,请指点
5楼2013-07-21 16:45:21
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by doubleping at 2013-07-21 12:00:11
我用的是touchdownPCR程序,65-55摄氏度,一分钟...

降落pcr没有问题,但是250bp延伸一分钟太长了,最多半分种足够了。我570bp才用40秒。
6楼2013-07-22 09:30:45
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doubleping

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by wubingqi at 2013-07-22 09:30:45
降落pcr没有问题,但是250bp延伸一分钟太长了,最多半分种足够了。我570bp才用40秒。...

嗯,谢谢,我再试试
7楼2013-07-22 10:41:06
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