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PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大 已有7人参与
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最近做PCR很郁闷 如图： 目的条带（上面 浅浅的）太弱 引物二聚体（下面)很亮 PCR条件优化时要么带很浅 要么没有带 最后优化成下图所示 带一直很浅 求解 先谢谢各位！！！ 引物是生工刚合成的 模板是新提的 带都很亮 PCR体系(25ul)：10×buffer: 2.5ul dNTP-MIX(10mM): 0.5ul 引物（10um)：各1.5ul 模板（4kb): 1ul（150ng左右） Tap DNA Polymerase(5U/ul): 0.5 ul 水:17.5ul PCR程序：94℃ 5min; 94℃ 1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃ 10min；共20个循环:  :cat39 |
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模板为4kd，长片段PCR为好。 长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求 2014-7-11 3kd-20kd的DNA片段适用长片段PCR扩增。 1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。 2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了20kd,甜茶碱可以少加点。 3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。 4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。 5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。 6.模板浓度最好在1ng/L以内。 7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.设计较长的PCR引物（25-30 bp) 其他同普通PCR。 |
19楼2014-07-17 00:08:05
zhangyunjing
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10楼2014-07-16 17:20:22
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滚环PCR直接扩载体？做定点突变的吧。。 1.引物不够长，你这种PCR退火温度至少得60甚至65度以上，必须要保证你的引物和模板的高特异性，一般的说明书上都建议两步PCR。温度越低引物二聚体越多。 2.你的酶得换换了，延伸速度太慢，至少换30s/1kb的保真酶，一般的酶不能胜任这个PCR 3.你的这个PCR后期转化真正需要的并不是上面那条带，而是带缺刻的环状DNA，上面那条带属于线性指数扩增的二联体引物条带，越多越不利于你后期转化后的筛选。 4.你扩完是不是需要用甲基化识别位点的限制性内切酶处理模板啊？处理完不要纯化了，适当稀释后直接转化就好，测序的时候多挑几个转化子，会有引物二联体，甚至三联体引物的假阳性出现。 |
20楼2014-07-17 03:59:40
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看你的引物，正反向是互补的，是做定点突变吗？如果做定点突变的话，给你推荐一个在线设计软件，我做过多次点突变，用这个软件设计的引物扩的都很好。QuikChange Primer Design。链接：https://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp 另外，如果做定点突变的话，需要采用保真性高的KOD或者Pfu酶，Taq酶做定点突变不行的 |
35楼2014-07-17 16:36:57
lippi21
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