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董庄青年

新虫 (初入文坛)

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[求助] PCR目的条带太弱并无非特异性条带怎样改进可以使目的产物的量加大已有7人参与

最近做PCR很郁闷  如图：目的条带（上面  浅浅的）太弱    引物二聚体（下面)很亮
PCR条件优化时要么带很浅  要么没有带最后优化成下图所示  带一直很浅  求解先谢谢各位！！！
引物是生工刚合成的模板是新提的带都很亮
PCR体系(25ul)：10×buffer: 2.5ul    dNTP-MIX(10mM): 0.5ul    引物（10um)：各1.5ul       模板（4kb): 1ul（150ng左右） Tap DNA Polymerase(5U/ul):  0.5 ul 水:17.5ul
PCR程序：94℃  5min; 94℃  1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃  10min；共20个循环:

:cat39

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1楼2014-07-16 10:55:17

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董庄青年

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引用回帖:

8楼: Originally posted by 代德艳 at 2014-07-16 16:14:49
这个引物也是以前用过的？...

这个是以前p出来的后来就怎么也p不出来了奇了怪了

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9楼2014-07-16 16:51:43

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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
董庄青年: 金币+1 2014-07-16 12:08:46
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 13:03:16

引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数偏少，可以设置到30-35 cycles。
如果你进行长片段扩增的话，有专门的长片段试剂盒，扩增效率很高的。

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rainwater

2楼2014-07-16 11:35:14

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董庄青年

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引用回帖:

2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数 ...

哦我的引物是同源引物形成二聚体是正常的而且我的目的条带是4kd就是整个质粒的长度以前能p出来最近就是不行

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3楼2014-07-16 12:22:21

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