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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大
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duanepp

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-17 10:12:29
循环数有些少，加到30左右。不过图片看的话，你的引物也不太合适，二聚体比较多。最好从新设计引物
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21楼2014-07-17 08:15:08
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
11楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-16 17:29:45
首先  谢谢你的回答
也试过了 分别把第一副图中的PCR产物1ul作为模板   稀释10倍取2ul作为模板  其他条件不变  做二次PCR出现涂抹带  都没有目的条带...

涂抹带  说明 模板太多了、你稀释50或100倍后，加2ul作为模板试试
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22楼2014-07-17 08:25:32
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xzy0425

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-17 12:20:10
既然合成产物以引物二聚体居多，你应该着重考虑引物方面，不妨降低引物用量为1μl，增加底物用量为1μl；同时避免使用同源引物，以免出现引物二聚体。又因为目的条带过于浅淡，说明目的条带合成量少，可以通过增加循环数来获得大量目的条带。
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23楼2014-07-17 09:04:18
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
20楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-17 03:59:40
滚环PCR直接扩载体？做定点突变的吧。。
1.引物不够长，你这种PCR退火温度至少得60甚至65度以上，必须要保证你的引物和模板的高特异性，一般的说明书上都建议两步PCR。温度越低引物二聚体越多。
2.你的酶得换换了 ...

3.你的这个PCR后期转化真正需要的并不是上面那条带，而是带缺刻的环状DNA，上面那条带属于线性指数扩增的二联体引物条带，越多越不利于你后期转化后的筛选。
谢谢你的回帖
可以有一点不太懂PCR产物不都是线性的吗   是不是这种滚环PCR直接扩载体P出来的就是环状DNA吗      我们实验室的师兄以前p完后用DpnI酶37℃ 水浴2h 处理模板DNA  然后就转化了  都挺好的啊
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24楼2014-07-17 09:37:34
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-17 12:20:30
引用回帖:
24楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-17 09:37:34
3.你的这个PCR后期转化真正需要的并不是上面那条带，而是带缺刻的环状DNA，上面那条带属于线性指数扩增的二联体引物条带，越多越不利于你后期转化后的筛选。
谢谢你的回帖
可以有一点不太懂PCR产物不都是线性的 ...

这种PCR最终产物主要有3种，
一种是以原始质粒模板的母环为基础，上下游引物分别在变性后的两条质粒单链上退火后延伸得到的一条链并没有封闭的两种缺刻环状DNA，这个数量由原始模板决定，不是指数扩增的。转化后可在宿主体内补齐
另一种产物是以上两种缺刻环状DNA再次变性后游离出的两条线性DNA之间退火，形成一条两端有你上下游引物的线性DNA，在taq酶作用下会把两边的引物补齐成双链，这个产物属于线性DNA双链，一旦形成可以进行指数扩增，循环数越多量越大，这种线性的DNA转化入宿主后有极低的概率自身环化形成多了一段你的引物序列的二联体质粒，但是由于这种指数扩增的产物本身量大，因此后期筛选转化子的时候挑到这种情况的概率不低，我的测序结果很多都是这种类型的质粒
第三种是两条线性DNA只在引物处退火，容易形成更长的线性片段，甚至是高聚物，不过这种产物理论上存在，实际不影响实验
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大家相互帮助哈
25楼2014-07-17 10:39:58
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
更正：
我总是习惯性地把PCR扩增的DNA片段的长度单位“kb”误写为“kd”，两个概念差距甚远，很不好意思。
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26楼2014-07-17 11:06:56
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leonaliu2013

木虫 (著名写手)
把退火温度降到53，做34个循环。试一下

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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27楼2014-07-17 11:22:12
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
25楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-17 10:39:58
这种PCR最终产物主要有3种，
一种是以原始质粒模板的母环为基础，上下游引物分别在变性后的两条质粒单链上退火后延伸得到的一条链并没有封闭的两种缺刻环状DNA，这个数量由原始模板决定，不是指数扩增的。转化后可 ...

加入 DpnI 酶 37℃水浴后  可以消除第一种产物的影响吧  第二种产物是我想要的东西 转感受态后长出来的菌落应该就是我想要的突变菌株吧 第三种产物可以不予考虑  
有个问题想请教一下   将1ul Dpn I 酶加入到50ul PCR反应后的溶液中（其中大概含有200ng模板DNA） 37℃水浴多长时间合适
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28楼2014-07-17 11:27:39
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-17 11:27:39
加入 DpnI 酶 37℃水浴后  可以消除第一种产物的影响吧  第二种产物是我想要的东西 转感受态后长出来的菌落应该就是我想要的突变菌株吧 第三种产物可以不予考虑  
有个问题想请教一下   将1ul Dpn I 酶加入到50ul ...

DpnI只能处理掉原始模板，200ng37度处理2h足够了。你确定你想要两条引物相连的转化子？
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大家相互帮助哈
29楼2014-07-17 11:47:00
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Deluger

银虫 (著名写手)
切胶回收，二次PCR

[ 发自小木虫客户端 ]
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30楼2014-07-17 12:10:11
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