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PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大 已有7人参与
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最近做PCR很郁闷 如图： 目的条带（上面 浅浅的）太弱 引物二聚体（下面)很亮 PCR条件优化时要么带很浅 要么没有带 最后优化成下图所示 带一直很浅 求解 先谢谢各位！！！ 引物是生工刚合成的 模板是新提的 带都很亮 PCR体系(25ul)：10×buffer: 2.5ul dNTP-MIX(10mM): 0.5ul 引物（10um)：各1.5ul 模板（4kb): 1ul（150ng左右） Tap DNA Polymerase(5U/ul): 0.5 ul 水:17.5ul PCR程序：94℃ 5min; 94℃ 1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃ 10min；共20个循环:  :cat39 |
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luwei13566
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-17 12:20:30
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-17 12:20:30
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这种PCR最终产物主要有3种， 一种是以原始质粒模板的母环为基础，上下游引物分别在变性后的两条质粒单链上退火后延伸得到的一条链并没有封闭的两种缺刻环状DNA，这个数量由原始模板决定，不是指数扩增的。转化后可在宿主体内补齐 另一种产物是以上两种缺刻环状DNA再次变性后游离出的两条线性DNA之间退火，形成一条两端有你上下游引物的线性DNA，在taq酶作用下会把两边的引物补齐成双链，这个产物属于线性DNA双链，一旦形成可以进行指数扩增，循环数越多量越大，这种线性的DNA转化入宿主后有极低的概率自身环化形成多了一段你的引物序列的二联体质粒，但是由于这种指数扩增的产物本身量大，因此后期筛选转化子的时候挑到这种情况的概率不低，我的测序结果很多都是这种类型的质粒 第三种是两条线性DNA只在引物处退火，容易形成更长的线性片段，甚至是高聚物，不过这种产物理论上存在，实际不影响实验 |
25楼2014-07-17 10:39:58
zhangyunjing
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2楼2014-07-16 11:35:14
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