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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大
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董庄青年

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大已有7人参与

最近做PCR很郁闷  如图： 目的条带（上面  浅浅的）太弱     引物二聚体（下面)很亮  
PCR条件优化时要么带很浅  要么没有带   最后优化成下图所示  带一直很浅  求解   先谢谢各位！！！
引物是生工刚合成的    模板是新提的   带都很亮   
PCR体系(25ul)：10×buffer: 2.5ul     dNTP-MIX(10mM): 0.5ul     引物（10um)：各1.5ul        模板（4kb): 1ul（150ng左右）   Tap DNA Polymerase(5U/ul):  0.5 ul   水:17.5ul
PCR程序：94℃  5min; 94℃  1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃  10min；共20个循环::cat39

PCR目的条带太弱 并无非特异性条带  怎样改进可以使目的产物的量加大
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1楼2014-07-16 10:55:17
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
董庄青年: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2014-07-17 09:27:20
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-17 10:11:32
滚环PCR直接扩载体？做定点突变的吧。。
1.引物不够长，你这种PCR退火温度至少得60甚至65度以上，必须要保证你的引物和模板的高特异性，一般的说明书上都建议两步PCR。温度越低引物二聚体越多。
2.你的酶得换换了，延伸速度太慢，至少换30s/1kb的保真酶，一般的酶不能胜任这个PCR
3.你的这个PCR后期转化真正需要的并不是上面那条带，而是带缺刻的环状DNA，上面那条带属于线性指数扩增的二联体引物条带，越多越不利于你后期转化后的筛选。
4.你扩完是不是需要用甲基化识别位点的限制性内切酶处理模板啊？处理完不要纯化了，适当稀释后直接转化就好，测序的时候多挑几个转化子，会有引物二联体，甚至三联体引物的假阳性出现。
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20楼2014-07-17 03:59:40
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-17 12:20:30
引用回帖:
24楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-17 09:37:34
3.你的这个PCR后期转化真正需要的并不是上面那条带，而是带缺刻的环状DNA，上面那条带属于线性指数扩增的二联体引物条带，越多越不利于你后期转化后的筛选。
谢谢你的回帖
可以有一点不太懂PCR产物不都是线性的 ...

这种PCR最终产物主要有3种，
一种是以原始质粒模板的母环为基础，上下游引物分别在变性后的两条质粒单链上退火后延伸得到的一条链并没有封闭的两种缺刻环状DNA，这个数量由原始模板决定，不是指数扩增的。转化后可在宿主体内补齐
另一种产物是以上两种缺刻环状DNA再次变性后游离出的两条线性DNA之间退火，形成一条两端有你上下游引物的线性DNA，在taq酶作用下会把两边的引物补齐成双链，这个产物属于线性DNA双链，一旦形成可以进行指数扩增，循环数越多量越大，这种线性的DNA转化入宿主后有极低的概率自身环化形成多了一段你的引物序列的二联体质粒，但是由于这种指数扩增的产物本身量大，因此后期筛选转化子的时候挑到这种情况的概率不低，我的测序结果很多都是这种类型的质粒
第三种是两条线性DNA只在引物处退火，容易形成更长的线性片段，甚至是高聚物，不过这种产物理论上存在，实际不影响实验
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25楼2014-07-17 10:39:58
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-17 11:27:39
加入 DpnI 酶 37℃水浴后  可以消除第一种产物的影响吧  第二种产物是我想要的东西 转感受态后长出来的菌落应该就是我想要的突变菌株吧 第三种产物可以不予考虑  
有个问题想请教一下   将1ul Dpn I 酶加入到50ul ...

DpnI只能处理掉原始模板，200ng37度处理2h足够了。你确定你想要两条引物相连的转化子？
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29楼2014-07-17 11:47:00
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-18 10:29:33
引用回帖:
32楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-17 12:30:12
弱弱的问一下两条引物相连的转化子是什么...

就是你的一部分转化子带有的质粒上带有连续两个引物序列。
还有纠正一下上面说的，DpnI能把所有的模板给消除掉，这个PCR里真正能正确转化的只有双链缺刻的环状DNA，跑电泳是看不到的，因此你扩完直接转化就好，不用管条那带的亮弱
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36楼2014-07-17 22:27:44
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
44楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-18 09:04:33
"一部分转化子带有的质粒上带有连续两个引物序列"   不好意思 还是不太懂  看来得恶补一下了  谢谢你的耐心指导  
那如果加Dpn I 酶消化处理后 双链缺刻的环状DNA不是也给破坏了？
还有就是我有 ...

哎，其实给你花个图一切都清楚了，有些东西难以用言语表达。
双链缺刻的环状dna完全是你的模板线性扩增后的线性片段退火形成的，没有任何甲基化位点，不会被处理。
你的这些假阳性是拿去测序发现质粒是原有模板而没有需要突变的位点吗，如果是这种情况那很可能模板消化的不好，这种PCR模板不能加太多，还有一种可能是你的引物特异性不好，没在指定的部位结合，滚环PCR设计的引物一般是突变位点在中间两边大于等于15bp，Tm大于等于78度，需要高特异性
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47楼2014-07-18 13:48:29
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