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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大
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董庄青年

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大 已有7人参与

最近做PCR很郁闷  如图： 目的条带（上面  浅浅的）太弱     引物二聚体（下面)很亮  
PCR条件优化时要么带很浅  要么没有带   最后优化成下图所示  带一直很浅  求解   先谢谢各位！！！
引物是生工刚合成的    模板是新提的   带都很亮   
PCR体系(25ul)：10×buffer: 2.5ul     dNTP-MIX(10mM): 0.5ul     引物（10um)：各1.5ul        模板（4kb): 1ul（150ng左右）   Tap DNA Polymerase(5U/ul):  0.5 ul   水:17.5ul
PCR程序：94℃  5min; 94℃  1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃  10min；共20个循环::cat39

PCR目的条带太弱 并无非特异性条带  怎样改进可以使目的产物的量加大
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1楼 2014-07-16 10:55:17
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
36楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-17 22:27:44
就是你的一部分转化子带有的质粒上带有连续两个引物序列。
还有纠正一下上面说的，DpnI能把所有的模板给消除掉，这个PCR里真正能正确转化的只有双链缺刻的环状DNA，跑电泳是看不到的，因此你扩完直接转化就好，不 ...

"一部分转化子带有的质粒上带有连续两个引物序列"   不好意思 还是不太懂  看来得恶补一下了  谢谢你的耐心指导  
那如果加Dpn I 酶消化处理后 双链缺刻的环状DNA不是也给破坏了？
还有就是我有时能P出很亮的带（其他突变体）转化后长出来的单菌落都是假阳性 （挑了十个菌落 全是假阳性）是消化不彻底  还是其他的原因
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44楼2014-07-18 09:04:33
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
董庄青年: 金币+1 2014-07-16 12:08:46
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 13:03:16
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数偏少，可以设置到30-35 cycles。
如果你进行长片段扩增的话，有专门的长片段试剂盒，扩增效率很高的。
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rainwater
2楼2014-07-16 11:35:14
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数 ...

哦  我的引物是同源引物   形成二聚体是正常的  而且我的目的条带是4kd就是整个质粒的长度   以前能p出来  最近就是不行
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3楼2014-07-16 12:22:21
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数 ...

引物1：5’-GGAGTTGATGGTGCAGGAAATGAATTG-3’
引物2：5’-CAATTCATTTCCTGCACCATCAACTCC-3’
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4楼2014-07-16 14:14:47
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