应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大
54/1返回列表
查看: 9378  |  回复: 51
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

董庄青年

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大 已有7人参与

最近做PCR很郁闷  如图： 目的条带（上面  浅浅的）太弱     引物二聚体（下面)很亮  
PCR条件优化时要么带很浅  要么没有带   最后优化成下图所示  带一直很浅  求解   先谢谢各位！！！
引物是生工刚合成的    模板是新提的   带都很亮   
PCR体系(25ul)：10×buffer: 2.5ul     dNTP-MIX(10mM): 0.5ul     引物（10um)：各1.5ul        模板（4kb): 1ul（150ng左右）   Tap DNA Polymerase(5U/ul):  0.5 ul   水:17.5ul
PCR程序：94℃  5min; 94℃  1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃  10min；共20个循环::cat39

PCR目的条带太弱 并无非特异性条带  怎样改进可以使目的产物的量加大
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2014-07-16 10:55:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-18 10:29:33
引用回帖:
32楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-17 12:30:12
弱弱的问一下两条引物相连的转化子是什么...

就是你的一部分转化子带有的质粒上带有连续两个引物序列。
还有纠正一下上面说的，DpnI能把所有的模板给消除掉，这个PCR里真正能正确转化的只有双链缺刻的环状DNA，跑电泳是看不到的，因此你扩完直接转化就好，不用管条那带的亮弱
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
36楼2014-07-17 22:27:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 52 个回答

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
董庄青年: 金币+1 2014-07-16 12:08:46
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 13:03:16
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数偏少，可以设置到30-35 cycles。
如果你进行长片段扩增的话，有专门的长片段试剂盒，扩增效率很高的。
赞一下(1人) 回复此楼
rainwater
2楼2014-07-16 11:35:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数 ...

哦  我的引物是同源引物   形成二聚体是正常的  而且我的目的条带是4kd就是整个质粒的长度   以前能p出来  最近就是不行
赞一下 回复此楼
3楼2014-07-16 12:22:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数 ...

引物1：5’-GGAGTTGATGGTGCAGGAAATGAATTG-3’
引物2：5’-CAATTCATTTCCTGCACCATCAACTCC-3’
赞一下 回复此楼
4楼2014-07-16 14:14:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 52 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 16:31 by 时光旅行者
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +3 tannykie 2026-08-29 3/150 2026-08-29 16:18 by manplx
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +9 苏东坡二世 2026-08-23 9/450 2026-08-29 14:41 by hustersqt
[公派出国] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 5/250 2026-08-29 14:23 by jCd0dEvKHShX
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 14:02 by jCd0dEvKHShX
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 13:51 by jCd0dEvKHShX
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 11:51 by jCd0dEvKHShX
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 11:40 by jCd0dEvKHShX
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 11:29 by jCd0dEvKHShX
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 9/450 2026-08-29 09:59 by jklily
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭