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PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大 已有7人参与
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最近做PCR很郁闷 如图： 目的条带（上面 浅浅的）太弱 引物二聚体（下面)很亮 PCR条件优化时要么带很浅 要么没有带 最后优化成下图所示 带一直很浅 求解 先谢谢各位！！！ 引物是生工刚合成的 模板是新提的 带都很亮 PCR体系(25ul)：10×buffer: 2.5ul dNTP-MIX(10mM): 0.5ul 引物（10um)：各1.5ul 模板（4kb): 1ul（150ng左右） Tap DNA Polymerase(5U/ul): 0.5 ul 水:17.5ul PCR程序：94℃ 5min; 94℃ 1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃ 10min；共20个循环:  :cat39 |
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luwei13566
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-17 10:11:32
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滚环PCR直接扩载体？做定点突变的吧。。 1.引物不够长，你这种PCR退火温度至少得60甚至65度以上，必须要保证你的引物和模板的高特异性，一般的说明书上都建议两步PCR。温度越低引物二聚体越多。 2.你的酶得换换了，延伸速度太慢，至少换30s/1kb的保真酶，一般的酶不能胜任这个PCR 3.你的这个PCR后期转化真正需要的并不是上面那条带，而是带缺刻的环状DNA，上面那条带属于线性指数扩增的二联体引物条带，越多越不利于你后期转化后的筛选。 4.你扩完是不是需要用甲基化识别位点的限制性内切酶处理模板啊？处理完不要纯化了，适当稀释后直接转化就好，测序的时候多挑几个转化子，会有引物二联体，甚至三联体引物的假阳性出现。 |
20楼2014-07-17 03:59:40
zhangyunjing
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