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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 梦想1995 at 2014-07-16 17:20:22
可以试试二次pcr，第一次pcr的产物作为第二次的模板

首先  谢谢你的回答
也试过了 分别把第一副图中的PCR产物1ul作为模板   稀释10倍取2ul作为模板  其他条件不变  做二次PCR出现涂抹带  都没有目的条带
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11楼2014-07-16 17:29:45
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
苦恼中  求大神们高见
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12楼2014-07-16 19:08:53
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rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
董庄青年: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-07-16 20:11:28
引用回帖:
12楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-16 19:08:53
苦恼中  求大神们高见

切胶回收，用回收产物二次pcr

[ 发自小木虫客户端 ]
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13楼2014-07-16 19:56:40
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by rodickholm at 2014-07-16 19:56:40
切胶回收，用回收产物二次pcr
...

感谢你的回帖   
  目的条带那么浅切胶回收量太少了吧
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14楼2014-07-16 20:11:10
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rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-16 20:11:10
感谢你的回帖   
  目的条带那么浅切胶回收量太少了吧...

回收低，再pcr就多了

[ 发自小木虫客户端 ]
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15楼2014-07-16 20:24:48
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by rodickholm at 2014-07-16 20:24:48
回收低，再pcr就多了
...

我的意思是回收后目的产物浓度太低    没办法当模板了
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16楼2014-07-16 20:27:53
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rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
董庄青年: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-16 21:02:09
引用回帖:
16楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-16 20:27:53
我的意思是回收后目的产物浓度太低    没办法当模板了...

可以的，绝对比你的原始模板高得多

[ 发自小木虫客户端 ]
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17楼2014-07-16 20:35:19
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by rodickholm at 2014-07-16 20:35:19
可以的，绝对比你的原始模板高得多
...

好吧  明天做个胶回收  二次PCR试试    谢谢
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18楼2014-07-16 21:01:23
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-17 10:11:51
gyesang: 回帖置顶 2014-07-18 15:36:39
模板为4kd，长片段PCR为好。

长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求

2014-7-11

3kd-20kd的DNA片段适用长片段PCR扩增。
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了20kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)
其他同普通PCR。
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19楼2014-07-17 00:08:05
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
董庄青年: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2014-07-17 09:27:20
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-17 10:11:32
滚环PCR直接扩载体？做定点突变的吧。。
1.引物不够长，你这种PCR退火温度至少得60甚至65度以上，必须要保证你的引物和模板的高特异性，一般的说明书上都建议两步PCR。温度越低引物二聚体越多。
2.你的酶得换换了，延伸速度太慢，至少换30s/1kb的保真酶，一般的酶不能胜任这个PCR
3.你的这个PCR后期转化真正需要的并不是上面那条带，而是带缺刻的环状DNA，上面那条带属于线性指数扩增的二联体引物条带，越多越不利于你后期转化后的筛选。
4.你扩完是不是需要用甲基化识别位点的限制性内切酶处理模板啊？处理完不要纯化了，适当稀释后直接转化就好，测序的时候多挑几个转化子，会有引物二联体，甚至三联体引物的假阳性出现。
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大家相互帮助哈
20楼2014-07-17 03:59:40
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