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PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大已有7人参与
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最近做PCR很郁闷 如图： 目的条带（上面 浅浅的）太弱 引物二聚体（下面)很亮 PCR条件优化时要么带很浅 要么没有带 最后优化成下图所示 带一直很浅 求解 先谢谢各位！！！ 引物是生工刚合成的 模板是新提的 带都很亮 PCR体系(25ul)：10×buffer: 2.5ul dNTP-MIX(10mM): 0.5ul 引物（10um)：各1.5ul 模板（4kb): 1ul（150ng左右） Tap DNA Polymerase(5U/ul): 0.5 ul 水:17.5ul PCR程序：94℃ 5min; 94℃ 1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃ 10min；共20个循环:  :cat39 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-17 10:11:51
gyesang: 回帖置顶 2014-07-18 15:36:39
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gyesang: 回帖置顶 2014-07-18 15:36:39
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模板为4kd，长片段PCR为好。 长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求 2014-7-11 3kd-20kd的DNA片段适用长片段PCR扩增。 1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。 2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了20kd,甜茶碱可以少加点。 3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。 4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。 5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。 6.模板浓度最好在1ng/L以内。 7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.设计较长的PCR引物（25-30 bp) 其他同普通PCR。 |
19楼2014-07-17 00:08:05
zhangyunjing
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