PCR目的条带太弱并无非特异性条带怎样改进可以使目的产物的量加大 - 分子生物 - PCR相关

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皇猪

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40cycles试试！！！

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没有梦想，那跟咸鱼有什么分别

41楼2014-07-18 08:26:00

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lippi21

铁杆木虫 (正式写手)

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退火温度降低到55度，引物量减少到1ul，模板量加到2ul。
循环数30。
不行的话将上次的PCR产物分别稀释100、1000、10000 倍当模板再试一次。条件不变。

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42楼2014-07-18 08:47:09

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董庄青年

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40楼: Originally posted by 未婚 at 2014-07-18 00:58:45
是做定点突变的吧？
...

恩是做定点突变不过现在问题已经解决了谢谢

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43楼2014-07-18 08:55:48

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董庄青年

新虫 (初入文坛)

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36楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-17 22:27:44
就是你的一部分转化子带有的质粒上带有连续两个引物序列。
还有纠正一下上面说的，DpnI能把所有的模板给消除掉，这个PCR里真正能正确转化的只有双链缺刻的环状DNA，跑电泳是看不到的，因此你扩完直接转化就好，不 ...

"一部分转化子带有的质粒上带有连续两个引物序列" 不好意思还是不太懂看来得恶补一下了谢谢你的耐心指导

那如果加Dpn I 酶消化处理后双链缺刻的环状DNA不是也给破坏了？
还有就是我有时能P出很亮的带（其他突变体）转化后长出来的单菌落都是假阳性（挑了十个菌落全是假阳性）是消化不彻底还是其他的原因

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44楼2014-07-18 09:04:33

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代德艳

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问题解决了？恭喜楼主

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45楼2014-07-18 11:13:50

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董庄青年

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45楼: Originally posted by 代德艳 at 2014-07-18 11:13:50
问题解决了？恭喜楼主

谢谢你们的指导啊

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46楼2014-07-18 12:20:42

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luwei13566

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44楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-18 09:04:33
"一部分转化子带有的质粒上带有连续两个引物序列" 不好意思还是不太懂看来得恶补一下了谢谢你的耐心指导

那如果加Dpn I 酶消化处理后双链缺刻的环状DNA不是也给破坏了？
还有就是我有 ...

哎，其实给你花个图一切都清楚了，有些东西难以用言语表达。
双链缺刻的环状dna完全是你的模板线性扩增后的线性片段退火形成的，没有任何甲基化位点，不会被处理。
你的这些假阳性是拿去测序发现质粒是原有模板而没有需要突变的位点吗，如果是这种情况那很可能模板消化的不好，这种PCR模板不能加太多，还有一种可能是你的引物特异性不好，没在指定的部位结合，滚环PCR设计的引物一般是突变位点在中间两边大于等于15bp，Tm大于等于78度，需要高特异性

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大家相互帮助哈

47楼2014-07-18 13:48:29

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人偶骑士

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9楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-16 16:51:43
这个是以前p出来的后来就怎么也p不出来了奇了怪了

...

目的条带是2K左右吗？72℃2min15s，30cycles足够了……6min太长了

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道之所在，虽千万人吾往矣！

48楼2014-07-24 16:33:34

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hajierlove

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10楼: Originally posted by 梦想1995 at 2014-07-16 17:20:22
可以试试二次pcr，第一次pcr的产物作为第二次的模板

二次pcr好用吗

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踏实

49楼2014-10-19 16:08:31

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hajierlove

铜虫 (正式写手)

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33楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-17 12:32:03
正在尝试谢谢...

楼主，尝试结果怎么样，出现了和你一样的问题

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踏实

50楼2014-10-19 16:11:28

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