应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大
53/1返回列表
查看: 8956  |  回复: 51
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

董庄青年

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大 已有7人参与

最近做PCR很郁闷  如图： 目的条带（上面  浅浅的）太弱     引物二聚体（下面)很亮  
PCR条件优化时要么带很浅  要么没有带   最后优化成下图所示  带一直很浅  求解   先谢谢各位！！！
引物是生工刚合成的    模板是新提的   带都很亮   
PCR体系(25ul)：10×buffer: 2.5ul     dNTP-MIX(10mM): 0.5ul     引物（10um)：各1.5ul        模板（4kb): 1ul（150ng左右）   Tap DNA Polymerase(5U/ul):  0.5 ul   水:17.5ul
PCR程序：94℃  5min; 94℃  1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃  10min；共20个循环::cat39

PCR目的条带太弱 并无非特异性条带  怎样改进可以使目的产物的量加大
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2014-07-16 10:55:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
11楼: Originally posted by 董庄青年 at 2014-07-16 17:29:45
首先  谢谢你的回答
也试过了 分别把第一副图中的PCR产物1ul作为模板   稀释10倍取2ul作为模板  其他条件不变  做二次PCR出现涂抹带  都没有目的条带...

涂抹带  说明 模板太多了、你稀释50或100倍后，加2ul作为模板试试
赞一下(1人) 回复此楼
22楼2014-07-17 08:25:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 52 个回答

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
董庄青年: 金币+1 2014-07-16 12:08:46
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 13:03:16
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数偏少，可以设置到30-35 cycles。
如果你进行长片段扩增的话，有专门的长片段试剂盒，扩增效率很高的。
赞一下(1人) 回复此楼
rainwater
2楼2014-07-16 11:35:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数 ...

哦  我的引物是同源引物   形成二聚体是正常的  而且我的目的条带是4kd就是整个质粒的长度   以前能p出来  最近就是不行
赞一下 回复此楼
3楼2014-07-16 12:22:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数 ...

引物1：5’-GGAGTTGATGGTGCAGGAAATGAATTG-3’
引物2：5’-CAATTCATTTCCTGCACCATCAACTCC-3’
赞一下 回复此楼
4楼2014-07-16 14:14:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 52 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿南昌大学，327分，材料与化工085600 +8 Ncdx123456 2026-03-19 8/400 2026-03-20 22:06 by JourneyLucky
[考研] 274求调剂 +9 S.H1 2026-03-18 9/450 2026-03-20 20:54 by zhukairuo
[考研] 085700资源与环境308求调剂 +11 墨墨漠 2026-03-18 12/600 2026-03-20 19:43 by 丁丁*
[考研] 299求调剂 +3 shxchem 2026-03-20 4/200 2026-03-20 19:23 by zhukairuo
[考研] 22408 344分 求调剂 一志愿 华电计算机技术 +3 solanXXX 2026-03-20 3/150 2026-03-20 16:41 by fxue1114
[考研] 0856调剂，是学校就去 +8 sllhht 2026-03-19 9/450 2026-03-20 14:25 by 无懈可击111
[考研] 271材料工程求调剂 +7 .6lL 2026-03-18 7/350 2026-03-20 09:10 by xingguangj
[考研] 0703化学调剂 +10 妮妮ninicgb 2026-03-15 14/700 2026-03-19 22:59 by 学员8dgXkO
[考博] 申博26年 +3 八6八68 2026-03-19 3/150 2026-03-19 19:43 by nxgogo
[考研] 288求调剂，一志愿华南理工大学071005 +5 ioodiiij 2026-03-17 5/250 2026-03-19 18:22 by zcl123
[考研] 332求调剂 +3 ydfyh 2026-03-17 3/150 2026-03-19 10:14 by 功夫疯狂
[考研] 本科郑州大学物理学院，一志愿华科070200学硕，346求调剂 +4 我不是一根葱 2026-03-18 4/200 2026-03-19 09:11 by 浮云166
[考研] 一志愿华中科技大学，080502，354分求调剂 +4 守候夕阳CF 2026-03-18 4/200 2026-03-18 22:16 by li123456789.
[考研] 【同济软件】软件（085405）考研求调剂 +3 2026eternal 2026-03-18 3/150 2026-03-18 19:09 by 搏击518
[考研] 一志愿武理材料305分求调剂 +5 想上岸的鲤鱼 2026-03-18 6/300 2026-03-18 17:53 by 无际的草原
[考研] 08工科 320总分 求调剂 +5 梨花珞晚风 2026-03-17 5/250 2026-03-18 14:49 by haxia
[考研] 0854，计算机类招收调剂 +3 胡辣汤放糖 2026-03-15 6/300 2026-03-18 12:09 by 上岸上岸……..
[考研] 326求调剂 +5 上岸的小葡 2026-03-15 6/300 2026-03-17 17:26 by ruiyingmiao
[考研] [导师推荐]西南科技大学国防/材料导师推荐 +3 尖角小荷 2026-03-16 6/300 2026-03-16 23:21 by 尖角小荷
[考研] 中科院材料273求调剂 +4 yzydy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 15:59 by Gaodh_82
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭