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董庄青年

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR目的条带太弱 并无非特异性条带 怎样改进可以使目的产物的量加大 已有7人参与

最近做PCR很郁闷  如图： 目的条带（上面  浅浅的）太弱     引物二聚体（下面)很亮  
PCR条件优化时要么带很浅  要么没有带   最后优化成下图所示  带一直很浅  求解   先谢谢各位！！！
引物是生工刚合成的    模板是新提的   带都很亮   
PCR体系(25ul)：10×buffer: 2.5ul     dNTP-MIX(10mM): 0.5ul     引物（10um)：各1.5ul        模板（4kb): 1ul（150ng左右）   Tap DNA Polymerase(5U/ul):  0.5 ul   水:17.5ul
PCR程序：94℃  5min; 94℃  1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃  10min；共20个循环::cat39

PCR目的条带太弱 并无非特异性条带  怎样改进可以使目的产物的量加大
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1楼 2014-07-16 10:55:17
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-18 10:29:22
看你的引物，正反向是互补的，是做定点突变吗？如果做定点突变的话，给你推荐一个在线设计软件，我做过多次点突变，用这个软件设计的引物扩的都很好。QuikChange Primer Design。链接：https://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp
另外，如果做定点突变的话，需要采用保真性高的KOD或者Pfu酶，Taq酶做定点突变不行的
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rainwater
35楼2014-07-17 16:36:57
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
董庄青年: 金币+1 2014-07-16 12:08:46
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 13:03:16
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数偏少，可以设置到30-35 cycles。
如果你进行长片段扩增的话，有专门的长片段试剂盒，扩增效率很高的。
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rainwater
2楼2014-07-16 11:35:14
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数 ...

哦  我的引物是同源引物   形成二聚体是正常的  而且我的目的条带是4kd就是整个质粒的长度   以前能p出来  最近就是不行
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3楼2014-07-16 12:22:21
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董庄青年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-16 11:35:14
引物设计的不好，大部分引物都形成引物二聚体了，扩增效率肯定低，不放把引物序列传上，帮你分析一下引物的质量如何。
另外，扩增的目的条带是多大？延伸时间设置6 min，循环数20 cycles，感觉延伸时间太长，循环数 ...

引物1：5’-GGAGTTGATGGTGCAGGAAATGAATTG-3’
引物2：5’-CAATTCATTTCCTGCACCATCAACTCC-3’
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4楼2014-07-16 14:14:47
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