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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物跑胶
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geyihui

新虫 (小有名气)

[求助] PCR产物跑胶 已有8人参与

请问我PCR（ps）产物比模板还要大，我模板是4.3Kb，我全部P，可是出来的条带在marker的5K那边，怎么回事，回事marker的问题吗
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1楼 2015-06-03 09:59:05
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

my_father

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-03 23:08:11
geyihui: 金币+1 2015-06-04 13:42:21
扩增后纯化过没？
如果没纯化过可能会结合Buffer中的阳离子，造成电泳速率变慢，再加上产量高上样量高就更显得大了。
如果是这样建议纯化后控制上样量看
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9楼2015-06-03 18:50:01
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普通回帖

calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
geyihui: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-06-03 13:21:04
要不然是模板不存，要不就是非特异性扩增，还有就是形成了二聚体。
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2楼2015-06-03 10:21:30
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geyihui

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-03 10:21:30
要不然是模板不存，要不就是非特异性扩增，还有就是形成了二聚体。

如果是非特异扩增和二聚体都应该不比模板大才对，我的模板是质粒，只有4.3k，可是产物比5k大，实验室小伙伴都没遇到过这个问题
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3楼2015-06-03 10:29:45
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calorimetry

铜虫 (正式写手)
那么就可能是有外来的DNA的污染。
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4楼2015-06-03 11:55:20
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zd1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-03 23:07:51
如果只能以质粒为模板进行扩增，那就尝试：1、用不同的试剂盒重新提取质粒，2、重新设计引物，3、优化PCR条件，4、找到包含你目的片段的长片段进行酶切，前提条件是质粒上有这样的酶切位点，又不至于把你的目的片段切断，得到这个长片段之后纯化作为模板再进行PCR。
如果可以从其它途径，例如基因组DNA上扩增你的目的片段，也尝试一下是否可以扩增到正确大小的目的片段。
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5楼2015-06-03 16:47:17
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geyihui

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zd1213 at 2015-06-03 16:47:17
如果只能以质粒为模板进行扩增，那就尝试：1、用不同的试剂盒重新提取质粒，2、重新设计引物，3、优化PCR条件，4、找到包含你目的片段的长片段进行酶切，前提条件是质粒上有这样的酶切位点，又不至于把你的目的片段 ...

我是在这个质粒为模板的条件下进行定点饱和突变（3个碱基NNN），所以用的这个质粒，好郁闷，引物已经重新设计了，先前是压根就p不出来
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6楼2015-06-03 17:07:20
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yhz0626

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
想问一下，扩增那么长的片段怎么测序呢

[ 发自小木虫客户端 ]
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7楼2015-06-03 17:09:13
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王冠傑

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以测个序试试呗
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8楼2015-06-03 17:19:46
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
引用回帖:
2楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-03 10:21:30
要不然是模板不存，要不就是非特异性扩增，还有就是形成了二聚体。

你见过二聚体有5K这么大的情况么。。。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-06-04 16:26:46
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