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daohaode4188

金虫 (小有名气)

[求助] PCR后跑胶为什么会出现这样的情况? 已有3人参与

如图,3kb多的条带,之前用一模一样的体系,可以P出来,但是最近就出不来了,酶,buffer没问题,引物也重新换了一下,胶用0.8%,1%,1.5%的也都试了下,还是跑不出来条带,想知道是什么原因额
第一张图的Maker左边。左右两边除了引物和P的大小不一样,用的体系都是一样的;
第二张图,有一些在点样孔里,不知道是什么情况;
第三张图是之前一模一样的体系P出来的

PCR后跑胶为什么会出现这样的情况?
第一张图


PCR后跑胶为什么会出现这样的情况?-1
第二张图


PCR后跑胶为什么会出现这样的情况?-2
第三张图
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cookiehuang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-23 12:34:46
如果酶没有问题的话,首先要确定引物和质粒有没有问题,我有次质粒放久了再用就这样
胶孔残留可能是胶的问题,避免用现成的胶,现配现用
2楼2014-10-18 15:22:03
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daohaode4188

金虫 (小有名气)

之前能跑出来条带的时候,都可以看到引物二聚体,现在连引物二聚体都看不到
3楼2014-10-18 21:20:44
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-23 12:34:50
不用管以前p不p得出来,建议:1减少模板量;2提高退火温度,或者做一个温度梯度,感觉你的问题是退火温度不够。至于没有了引物二聚体,你看你做出来的有那么多非特异性的弥散亮带,引物早就被用完了。
4楼2014-10-18 22:16:08
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forAM

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by junior850621 at 2014-10-18 22:16:08
不用管以前p不p得出来,建议:1减少模板量;2提高退火温度,或者做一个温度梯度,感觉你的问题是退火温度不够。至于没有了引物二聚体,你看你做出来的有那么多非特异性的弥散亮带,引物早就被用完了。

也有可能退火温度过高,引物结合不上去,可以试试降低退火温度。
5楼2014-10-22 18:49:01
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-23 12:34:55
拖尾的话可能是电压问题,我之前较高电压跑的时候也会出现这种问题,降了电压之后就很少见了···还有就是如果用质粒P的话,不要按计算的DNA浓度加,只要加很少就行了,要不然P不出来,或者很多杂带···
···
6楼2014-10-22 19:52:56
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派派_Ida

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 小冀- at 2014-10-22 19:52:56
拖尾的话可能是电压问题,我之前较高电压跑的时候也会出现这种问题,降了电压之后就很少见了···还有就是如果用质粒P的话,不要按计算的DNA浓度加,只要加很少就行了,要不然P不出来,或者很多杂带···

我也是这种情况,如图一,请问楼主最后怎么解决的
7楼2015-11-19 11:41:07
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