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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 进行overlap pcr，结果不仅没有目的片段，跑胶的条带都比模板长度还短
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blodemaster

新虫 (初入文坛)

[求助] 进行overlap pcr，结果不仅没有目的片段，跑胶的条带都比模板长度还短 已有3人参与

最近小弟正在做clone，想通过overlap pcr把两组已经fusion过的基因（两个基因已经连接了）再连接在一起，
pcr也采用了2步法，先将两个模板（每个2μl）（长度都在1.5kb左右）以60°c退火温度，做15个循环
之后加1μl的F，1μ的R引物，再以touchdown（从60-50°c）做10个cycle，最后以50°c的退火温度循环25次
结果跑胶不仅没有目的条带，而且p出来的条带在500bp，和120bp

附：marker用的DM5000
进行overlap pcr，结果不仅没有目的片段，跑胶的条带都比模板长度还短
3-10-(+u)2.jpg
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1楼 2014-03-10 16:09:12
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-03-11 09:41:42
我是将目的片段纯化后，作为模板，直接以常规pcr的体系和程序进行overlapping；所幸每次均能获预期结果
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做一个阳光、开朗的小和尚
2楼2014-03-10 20:57:14
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小尾巴亚杰

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流经验！ 2014-03-31 15:37:23
我overlap PCR的时候都是直接把俩片段，加引物还有酶啊之类的全加进去，直接PCR，每次都能扩出来啊
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3楼2014-03-11 09:57:37
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yuting916468

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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blodemaster(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 15:37:32
之前做overlap pcr都是将两个模板pcr纯化后再融合的。片段变小一般都是引物结合的问题可以优化一下。我现在做融合都是用无缝克隆酶，直接在一个基因后面插入一个基因。
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4楼2014-03-11 10:34:00
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