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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我想做3个基因的overlap pcr ，不知怎样做才好
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zdx516

铁虫 (小有名气)

[求助] 我想做3个基因的overlap pcr ，不知怎样做才好

各位大侠，我想做3个基因的overlap pcr ，不知怎样做才好，已经设计好了引物，分别扩增出，并回收了3段基因，想把它们连起来，是两两组合overlap,还是三个一起呢？退火温度有什么需要注意的么?非常感谢
片段A  800多bp,片段B 1300bp，片段C  800 多bp, 重叠18-21个

[ Last edited by zdx516 on 2013-3-13 at 15:37 ]
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1楼 2013-03-13 15:35:14
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gyesang

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接三个片段放一起，只加首尾两条引物，扩出条带应该没问题。
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2楼2013-03-13 16:24:51
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zdx516

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-13 16:24:51
直接三个片段放一起，只加首尾两条引物，扩出条带应该没问题。

你好，我做了几次，大小都不对，前辈看看我的做法是否有些不妥之处
我把片段U、T、D分别扩增回收后。
25ul体系：
U   1ul
T   1UL
D   1UL
dNTP 2ul
10*buffer 2.5ul
pfu 酶   0.2ul
ddH2O   15.3ul
94度 3min
以下10个循环：
94   30s
50,52,55,58,60度 40s
72   2min
扩增10个循环后，将产物做2倍稀释后，作为模板A
50ul体系：
模板A    3ul
dNTP  4ul
最前和最后一个引物  各2ul
Taq 酶   0.5ul
10*buffer 5ul
ddH2O  33.5ul
94度 5min
以下30个循环：
94   30s
50,52,55,58,60度 40s
72   2min
最后72  10min
每次大小都不对，变得小了，谢谢
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3楼2013-03-19 21:34:52
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zdx516: 金币+5, ★有帮助 2013-03-27 16:45:47
引用回帖:
3楼: Originally posted by zdx516 at 2013-03-19 21:34:52
你好，我做了几次，大小都不对，前辈看看我的做法是否有些不妥之处
我把片段U、T、D分别扩增回收后。
25ul体系：
U   1ul
T   1UL
D   1UL
dNTP 2ul
10*buffer 2.5ul
pfu 酶   0.2ul
ddH2O   15.3ul
94 ...

不行的话，你先U和T扩，跑胶回收，然后回收产物再和D跑

或者UT跑，TD跑，然后产物回收，两个产物再放一起跑
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-03-20 01:28:07
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zdx516

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-20 01:28:07
不行的话，你先U和T扩，跑胶回收，然后回收产物再和D跑

或者UT跑，TD跑，然后产物回收，两个产物再放一起跑...

我两种方法都做了，就是大小不对，电泳检测好多带，就是没有接近理论大小的条带，哎，怎么办呢
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5楼2013-03-21 15:31:37
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sirius-19

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你好，最近我也在做三个片段的overlap,除了前两次成功外，后来结果就不理想了。正常的做法应该是先overlap前两段，后与第三段相连，我们可以讨论下
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6楼2013-03-22 12:20:45
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hndong.tju

木虫 (小有名气)
你好，最近我也在做三个片段的overlap,不知楼主现在P出来了吗？
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7楼2013-04-27 10:01:28
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hongtaowang_

新虫 (初入文坛)
你好，我想请问overlap pcR的问题，您方便给我电话，我可以给您打电话么？
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8楼2015-07-03 16:27:14
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