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zdx516铁虫 (小有名气)
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我想做3个基因的overlap pcr ，不知怎样做才好
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各位大侠，我想做3个基因的overlap pcr ，不知怎样做才好，已经设计好了引物，分别扩增出，并回收了3段基因，想把它们连起来，是两两组合overlap,还是三个一起呢？退火温度有什么需要注意的么?非常感谢 片段A 800多bp,片段B 1300bp，片段C 800 多bp, 重叠18-21个 [ Last edited by zdx516 on 2013-3-13 at 15:37 ] |
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2楼2013-03-13 16:24:51
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你好，我做了几次，大小都不对，前辈看看我的做法是否有些不妥之处 我把片段U、T、D分别扩增回收后。 25ul体系： U 1ul T 1UL D 1UL dNTP 2ul 10*buffer 2.5ul pfu 酶 0.2ul ddH2O 15.3ul 94度 3min 以下10个循环： 94 30s 50,52,55,58,60度 40s 72 2min 扩增10个循环后，将产物做2倍稀释后，作为模板A 50ul体系： 模板A 3ul dNTP 4ul 最前和最后一个引物 各2ul Taq 酶 0.5ul 10*buffer 5ul ddH2O 33.5ul 94度 5min 以下30个循环： 94 30s 50,52,55,58,60度 40s 72 2min 最后72 10min 每次大小都不对，变得小了，谢谢 |
3楼2013-03-19 21:34:52
gyesang
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