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daohaode4188

金虫 (小有名气)

[求助] PCR后跑胶为什么会出现这样的情况？ 已有3人参与

如图，3kb多的条带，之前用一模一样的体系，可以P出来，但是最近就出不来了，酶，buffer没问题，引物也重新换了一下，胶用0.8%，1%，1.5%的也都试了下，还是跑不出来条带，想知道是什么原因额
第一张图的Maker左边。左右两边除了引物和P的大小不一样，用的体系都是一样的；
第二张图，有一些在点样孔里，不知道是什么情况；
第三张图是之前一模一样的体系P出来的

PCR后跑胶为什么会出现这样的情况？
第一张图


PCR后跑胶为什么会出现这样的情况？-1
第二张图


PCR后跑胶为什么会出现这样的情况？-2
第三张图
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1楼 2014-10-18 10:56:01
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-23 12:34:50
不用管以前p不p得出来，建议：1减少模板量；2提高退火温度，或者做一个温度梯度，感觉你的问题是退火温度不够。至于没有了引物二聚体，你看你做出来的有那么多非特异性的弥散亮带，引物早就被用完了。
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4楼2014-10-18 22:16:08
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cookiehuang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-23 12:34:46
如果酶没有问题的话，首先要确定引物和质粒有没有问题，我有次质粒放久了再用就这样
胶孔残留可能是胶的问题，避免用现成的胶，现配现用
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2楼2014-10-18 15:22:03
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daohaode4188

金虫 (小有名气)
之前能跑出来条带的时候，都可以看到引物二聚体，现在连引物二聚体都看不到
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3楼2014-10-18 21:20:44
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forAM

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by junior850621 at 2014-10-18 22:16:08
不用管以前p不p得出来，建议：1减少模板量；2提高退火温度，或者做一个温度梯度，感觉你的问题是退火温度不够。至于没有了引物二聚体，你看你做出来的有那么多非特异性的弥散亮带，引物早就被用完了。

也有可能退火温度过高，引物结合不上去，可以试试降低退火温度。
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5楼2014-10-22 18:49:01
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