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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » miRNA反转录后PCR产物跑电泳，有点拖尾，什么原因啊？真心求助！！
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没入尘埃5

金虫 (小有名气)

[求助] miRNA反转录后PCR产物跑电泳，有点拖尾，什么原因啊？真心求助！！

我反转录的时候用了250ng的miRNA，反转后PCR用了“模板0.4微升，引物各0.8微升，rTaq酶0.1微升，buffer 2微升，dNTP 1.6微升，水14.3微升”的20微升体系，PCR的时候用的实时定量PCR的程序，电泳检测用4%琼脂糖胶，Marker用20bp的。结果电泳条带拖尾，图中1、3、5、7是用看家基因验证的模板，2、4、6、8是我的目的条带，但是2、4、6拖尾，真的不知道什么原因了。真心求助啊！！求各位大仙帮忙啊！！！
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如果不努力，肯定没收获！
1楼 2012-09-02 20:43:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lma223

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
没入尘埃5: 金币+2, ★有帮助 2012-09-04 13:32:08
小丹木木: 金币+3, 热心的新虫虫，谢谢对分子版的支持 2012-09-04 13:47:43
1）RNA是否有降解
2）引物是否有非特异性扩增 用Primer3或者Blast 检测
3）microRNA  gene是否有alternative splicing 或者alternative polyadenylation( heterogeneous) 存在
4）模版浓度过大，dNTP不足，导致PCR heteroduplex形成
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知行合一，致良知！
5楼2012-09-04 10:32:40
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普通回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看不到你的图，产物大小事多大啊？是不是你的胶浓度不对啊？
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生物化学与分子生物学
2楼2012-09-02 22:02:28
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没入尘埃5

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-02 22:02:28
看不到你的图，产物大小事多大啊？是不是你的胶浓度不对啊？

我不知道怎么往上面贴图，就上传了，不知道怎么不能下载，唉，我的胶是4%琼脂糖胶，Marker用20bp的，我的产物是80bp左右的
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如果不努力，肯定没收获！
3楼2012-09-03 09:17:14
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
没入尘埃5: 金币+1 2012-09-04 13:31:02
引用回帖:
3楼: Originally posted by 没入尘埃5 at 2012-09-03 09:17:14
我不知道怎么往上面贴图，就上传了，不知道怎么不能下载，唉，我的胶是4%琼脂糖胶，Marker用20bp的，我的产物是80bp左右的...

产物这么小啊，胶浓度你可以试下2%、3%或者5%
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生物化学与分子生物学
4楼2012-09-04 07:52:54
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没入尘埃5

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lma223 at 2012-09-04 10:32:40
1）RNA是否有降解
2）引物是否有非特异性扩增 用Primer3或者Blast 检测
3）microRNA  gene是否有alternative splicing 或者alternative polyadenylation( heterogeneous) 存在
4）模版浓度过大，dNTP不足，导致P ...

RNA应该是没有降解，模板浓度也不大，这两种可能应该不是，但是引物确实是有非特异性扩增，之前预实验的时候验证着有的引物是没有非特异性扩增的，现在正式开始实验时本来没有非特异性扩增的引物的条带也不那么清楚了，有拖尾，miRNA的提取和反转录过程都是一样的，怎么回事呢？？急死了
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如果不努力，肯定没收获！
6楼2012-09-04 13:35:45
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zhaoyang1005

木虫 (初入文坛)
看看 谢谢谢想
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7楼2012-09-04 13:36:49
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没入尘埃5

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-04 07:52:54
产物这么小啊，胶浓度你可以试下2%、3%或者5%...

因为是小片段的产物，所以只能用大浓度的胶，看有的文献上说的是用4%的胶
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如果不努力，肯定没收获！
8楼2012-09-04 13:37:36
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没入尘埃5

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhaoyang1005 at 2012-09-04 13:36:49
看看 谢谢谢想

什么意思啊？？
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如果不努力，肯定没收获！
9楼2012-09-04 13:53:25
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 没入尘埃5 at 2012-09-04 13:37:36
因为是小片段的产物，所以只能用大浓度的胶，看有的文献上说的是用4%的胶...

恩，用百分之三试试，
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生物化学与分子生物学
10楼2012-09-04 16:06:35
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