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没入尘埃5

金虫 (小有名气)

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[求助] miRNA反转录后PCR产物跑电泳，有点拖尾，什么原因啊？真心求助！！

我反转录的时候用了250ng的miRNA，反转后PCR用了“模板0.4微升，引物各0.8微升，rTaq酶0.1微升，buffer 2微升，dNTP 1.6微升，水14.3微升”的20微升体系，PCR的时候用的实时定量PCR的程序，电泳检测用4%琼脂糖胶，Marker用20bp的。结果电泳条带拖尾，图中1、3、5、7是用看家基因验证的模板，2、4、6、8是我的目的条带，但是2、4、6拖尾，真的不知道什么原因了。真心求助啊！！求各位大仙帮忙啊！！！

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附件 1 : 2012.09.02-3.bmp

2012-09-02 20:36:32, 1.17 M

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1楼 2012-09-02 20:43:22

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引用回帖:

2楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-02 22:02:28
看不到你的图，产物大小事多大啊？是不是你的胶浓度不对啊？

我不知道怎么往上面贴图，就上传了，不知道怎么不能下载，唉，我的胶是4%琼脂糖胶，Marker用20bp的，我的产物是80bp左右的

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3楼2012-09-03 09:17:14

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引用回帖:

5楼: Originally posted by lma223 at 2012-09-04 10:32:40
1）RNA是否有降解
2）引物是否有非特异性扩增用Primer3或者Blast 检测
3）microRNA gene是否有alternative splicing 或者alternative polyadenylation( heterogeneous) 存在
4）模版浓度过大，dNTP不足，导致P ...

RNA应该是没有降解，模板浓度也不大，这两种可能应该不是，但是引物确实是有非特异性扩增，之前预实验的时候验证着有的引物是没有非特异性扩增的，现在正式开始实验时本来没有非特异性扩增的引物的条带也不那么清楚了，有拖尾，miRNA的提取和反转录过程都是一样的，怎么回事呢？？急死了

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6楼2012-09-04 13:35:45

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