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Mis_Q银虫 (小有名气)
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[求助]
（基因克隆）双酶切结果与目的条带大小不一致，求有经验的人帮帮我。 已有2人参与
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1. 目的条带加酶切位点一共1200bp左右，酶切位点是Bgl II （Buffer 3.1）和Nhe I（Buffer 2.1），内切酶是NEB公司的。克隆载体为TaKaRa 的 T-Vector pMD 19 ( Simple ), 载体长度为2692 bp。 2. 将目的产物连接到克隆载体后，转化大肠杆菌 (DH5α)，蓝白斑筛选，挑取白色单个菌落后过夜培养，提取质粒。 3. 对菌液和质粒都进行PCR验证，结果均出现目的条带。  以上为质粒PCR图片 4. 检测质粒浓度后参考NEB提供体系先分别进行两个酶的单酶切。 体系： 酶 1 μl ； DNA 1 μg； 10*NEBuffer 5 μl； 总体系 50 μl 反应条件：37℃ 水浴过夜，Bgl II 加TaKaRa 6*Load Buffer终止反应，Nhe I 65℃ 20min 使用PCR仪终止反应。 单酶切结果： 琼脂糖凝胶结果发现，两个酶均出现2000 bp左右片段，同时与质粒一起跑胶，发现条带比质粒稍大一点。  5. 之前也试过分步双酶切，先Bgl II 37℃过夜，然后琼脂糖凝胶回收，再Nhe I 37℃过夜，结果凝胶结果完全没有条带，怀疑割胶回收损失太大。   6. 先进行Nhe I 酶切（50ul体系），然后吸出6ul，再加入Bgl II和Buffer 3.1共6ul，补足50ul后继续酶切，这次仍然没有出现目的大小片段。 37℃水浴过夜，pcr仪5h，都试过了，每次出来都是2000bp大小的条带。因为第一次做酶切反应，所以现在已经完全不知道该怎么办了，希望有经验的人来帮帮我看看是哪里出的问题，非常感谢！ 非常抱歉内容写的有点多  。 |
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