| 查看: 5260 | 回复: 4 | ||
Mis_Q银虫 (小有名气)
|
[求助]
（基因克隆）双酶切结果与目的条带大小不一致，求有经验的人帮帮我。 已有2人参与
|
|
1. 目的条带加酶切位点一共1200bp左右，酶切位点是Bgl II （Buffer 3.1）和Nhe I（Buffer 2.1），内切酶是NEB公司的。克隆载体为TaKaRa 的 T-Vector pMD 19 ( Simple ), 载体长度为2692 bp。 2. 将目的产物连接到克隆载体后，转化大肠杆菌 (DH5α)，蓝白斑筛选，挑取白色单个菌落后过夜培养，提取质粒。 3. 对菌液和质粒都进行PCR验证，结果均出现目的条带。  以上为质粒PCR图片 4. 检测质粒浓度后参考NEB提供体系先分别进行两个酶的单酶切。 体系： 酶 1 μl ； DNA 1 μg； 10*NEBuffer 5 μl； 总体系 50 μl 反应条件：37℃ 水浴过夜，Bgl II 加TaKaRa 6*Load Buffer终止反应，Nhe I 65℃ 20min 使用PCR仪终止反应。 单酶切结果： 琼脂糖凝胶结果发现，两个酶均出现2000 bp左右片段，同时与质粒一起跑胶，发现条带比质粒稍大一点。  5. 之前也试过分步双酶切，先Bgl II 37℃过夜，然后琼脂糖凝胶回收，再Nhe I 37℃过夜，结果凝胶结果完全没有条带，怀疑割胶回收损失太大。   6. 先进行Nhe I 酶切（50ul体系），然后吸出6ul，再加入Bgl II和Buffer 3.1共6ul，补足50ul后继续酶切，这次仍然没有出现目的大小片段。 37℃水浴过夜，pcr仪5h，都试过了，每次出来都是2000bp大小的条带。因为第一次做酶切反应，所以现在已经完全不知道该怎么办了，希望有经验的人来帮帮我看看是哪里出的问题，非常感谢！ 非常抱歉内容写的有点多  。 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有66人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 质粒分别酶切均有正确条带，但双酶切只有一条条带，这是怎么回事？
已经有5人回复
- 双酶切怎么操作才能完全彻底呢！
已经有27人回复
- 连接克隆载体提取质粒结果跑出两条带
已经有11人回复
- PBI121载体与目的片段连接后双酶切问题
已经有23人回复
- 单酶切跟双酶切电泳条带一样，且都比空质粒跑的快，什么原因？
已经有7人回复
- 求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！
已经有32人回复
- 双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？
已经有36人回复
- Ecor Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切结果，目的条带有，可是另一条带比原来质粒还要大，怎么解释呢
已经有6人回复
- pMD19-T双酶切，目的片段上酶切位点和载体上一样
已经有7人回复
- 双酶切切出来三条带
已经有31人回复
- NdeI,BamHI双酶切
已经有8人回复
- 酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？
已经有14人回复
- 新人，请大侠赐教：构建重组质粒选择双酶切还是单酶切？
已经有13人回复
- 我用sal Ⅰ和xho Ⅰ双酶切链接目的基因，菌落pcr能p出目的条带，但酶切切不开。
已经有18人回复
- 载体酶切位点与目的片段重复
已经有13人回复
- 纠结的分子实验，双酶切连不上，求助
已经有14人回复
- 质粒双酶切BSA怎么加？
已经有15人回复
- pet28a双酶切出现这种情况
已经有10人回复
- PCR产物直接双酶切后电泳看不到条带
已经有30人回复
- pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
已经有23人回复
- 双酶切后目的条带很淡，回收不到
已经有15人回复
- 重组质粒单双酶切结果一样，奇怪了的……
已经有15人回复
- 双酶切后目的条带的疑问？
已经有8人回复
- 双酶切后载体片段变小
已经有8人回复
- T载体酶切片段与目的片段大小不一致
已经有12人回复
- 提取的质粒跑出四条或者五条带，但酶切后只有一条带，是不是我的质粒污染了
已经有18人回复
- 十万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序有结果，但反复说我质粒浓度很低
已经有16人回复
Mis_Q
银虫 (小有名气)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 228.9
- 散金: 50
- 帖子: 101
- 在线: 43.4小时
- 虫号: 1988967
- 注册: 2012-09-10
- 性别: MM
- 专业: 生物材料
2楼2015-04-01 08:17:20
yesucao
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 51 (初中生)
- 金币: 3877.1
- 散金: 45
- 红花: 6
- 帖子: 374
- 在线: 203.4小时
- 虫号: 810829
- 注册: 2009-07-17
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2015-04-01 10:00:45
Mis_Q
银虫 (小有名气)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 228.9
- 散金: 50
- 帖子: 101
- 在线: 43.4小时
- 虫号: 1988967
- 注册: 2012-09-10
- 性别: MM
- 专业: 生物材料
4楼2015-04-02 15:10:57
linglingys
新虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 1304
- 散金: 35
- 红花: 6
- 帖子: 261
- 在线: 70.6小时
- 虫号: 2495787
- 注册: 2013-06-04
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
5楼2015-06-09 09:37:02
