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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » （基因克隆）双酶切结果与目的条带大小不一致，求有经验的人帮帮我。
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Mis_Q

银虫 (小有名气)

[求助] （基因克隆）双酶切结果与目的条带大小不一致，求有经验的人帮帮我。 已有2人参与

1.  目的条带加酶切位点一共1200bp左右，酶切位点是Bgl II （Buffer 3.1）和Nhe I（Buffer 2.1），内切酶是NEB公司的。克隆载体为TaKaRa 的 T-Vector pMD 19 ( Simple ), 载体长度为2692 bp。
   2.  将目的产物连接到克隆载体后，转化大肠杆菌 (DH5α)，蓝白斑筛选，挑取白色单个菌落后过夜培养，提取质粒。
   3.  对菌液和质粒都进行PCR验证，结果均出现目的条带。

以上为质粒PCR图片
   4.  检测质粒浓度后参考NEB提供体系先分别进行两个酶的单酶切。
                         体系：  酶                         1 μl ；
                                     DNA                      1 μg；  
                                     10*NEBuffer          5 μl；
                                      总体系                  50 μl                    反应条件：37℃ 水浴过夜，Bgl II 加TaKaRa 6*Load Buffer终止反应，Nhe I  65℃  20min 使用PCR仪终止反应。
单酶切结果： 琼脂糖凝胶结果发现，两个酶均出现2000 bp左右片段，同时与质粒一起跑胶，发现条带比质粒稍大一点。

  5.    之前也试过分步双酶切，先Bgl II 37℃过夜，然后琼脂糖凝胶回收，再Nhe I 37℃过夜，结果凝胶结果完全没有条带，怀疑割胶回收损失太大。
   
  6.  先进行Nhe I 酶切（50ul体系），然后吸出6ul，再加入Bgl II和Buffer 3.1共6ul，补足50ul后继续酶切，这次仍然没有出现目的大小片段。

   37℃水浴过夜，pcr仪5h，都试过了，每次出来都是2000bp大小的条带。因为第一次做酶切反应，所以现在已经完全不知道该怎么办了，希望有经验的人来帮帮我看看是哪里出的问题，非常感谢！  非常抱歉内容写的有点多。
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1楼 2015-03-31 16:03:18
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Mis_Q

银虫 (小有名气)
怎么没有人呢，自己顶一个
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2楼2015-04-01 08:17:20
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Mis_Q: 金币+5 2015-04-02 15:11:48
你的PCR验证应该没有什么问题，问题的关键是酶切。
建议：酶切体系为20ul，两种酶各1ul，质粒1-2ul，37度水浴2h，跑电泳检测就ok了。
你的目的是验证插入条带，没必要过夜酶切。
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3楼2015-04-01 10:00:45
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Mis_Q

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yesucao at 2015-04-01 10:00:45
你的PCR验证应该没有什么问题，问题的关键是酶切。
建议：酶切体系为20ul，两种酶各1ul，质粒1-2ul，37度水浴2h，跑电泳检测就ok了。
你的目的是验证插入条带，没必要过夜酶切。

今天跟技术咨询了一下，怀疑是我没有把目的片段连接上去（因为测序也不出结果），出现的PCR产物为假阳性，我也是凌乱了。
下一步准备把空载体和我提出来的质粒同时做酶切验证，并且对PCR产物也做酶切验证，因为怀疑酶切位点的设计是不是有问题，比如目的序列或者载体上的相似序列会产生非特异性酶切。
另外准备对PCR产物进行测序，看看到底是不是假阳性。
对于酶切体系我没有改过，一直是按照NEB提供的体系来做的。
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4楼2015-04-02 15:10:57
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linglingys

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主，我想咨询下你T/A克隆用TAKARA试剂盒，连接反应16°C多久？本人连接30min做，连阳性对照都没有任何菌落。培养基是含Amp、X-gal、IPTG，但我是先做了含Amp平板再涂X-gal、IPTG在表面，不知道是否影响生长？
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5楼2015-06-09 09:37:02
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