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NdeI,BamHI双酶切
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| 我用NedI和BamHI双酶切我的目的片段然后和28a连接。试着改变了多次酶切酶连条件，但一直都转化不出来。28a切完后跑电泳与质粒比较应该是切开的。现在不知道问题到底是出在哪里了。求各位帮忙分析一下，可能的原因以及解决的方案吧~谢谢~~感激不尽！ |
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4楼2013-08-15 14:48:07
gyesang
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7楼2013-08-15 15:39:22
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1、用通用缓冲液进行双酶切，酶量不可太多，例如2~3mL培养过夜菌体，Kit提取质粒用40uLDDW洗脱下来，可加NdeI 2~3U，BamHI 1~2U,混匀后37℃，酶切1.5h即可，酶量不能太多，酶切时间不宜太长； 2、胶回收不要用低熔点琼脂糖，譬如用Agarose H，胶浓度用0.5%，胶长度~15~20cm(可将常用的两灌胶槽用胶带串接在一起)，准备冷冻的电极缓冲液中间更换缓冲液，或冻制缓冲冰块，中间加入冷却，电压用120~140V，电泳时间~1.5-2.5h,注意除了电Marker样品外，还带上未酶切的载体样作对比； 3、用常规胶回收试剂盒回收，熔胶稳定控制在50℃左右，6~10mins，柱中目标片段用30uL水洗脱下来，一定要电泳检视，取3~5ul点样，应该条带清晰，无降解和聚集等杂带； 4、待插入的双酶切目标基因按常规操作，最后回收样也要电泳检视质量可靠后，再与载体连接。 |
8楼2018-11-19 09:52:27
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1.如果你有含插入基因（最好大于1kb，愈大更好）的pET类载体，还可再用NdeI/BamHI双切则比较方便，直接用NdeI/BamHI双切，低浓度加长胶电泳可回收到酶切好的高质量的pET-NdeI/BamHI备用载体；若只有原始载体，因为NdeI或BamHI均不能保证100%切开，特别NdeI大致只有70%，因此你双酶切的载体中大致有30%的载体仅仅是完成单切，因此你的载体再连接时，相当于连接液中原始载体特别高，而目的连接载体不多，需要筛选比较多的克隆才可能筛选到你的目标克隆； 2.其次，由于插入用载体质量差，连接时还是按连接说明书中载体/基因=1:5的比例，那么合格的连接所占比例就非常低，转化筛选自然困难；此时可用可用1:1或2:1比例； 3.NdeI的保护碱基比较特别，可在百度中输入“限制性内切酶保护碱基”，可查找到有关保护碱基设计的文章参考，不然你的插入基因根本就没有NdeI粘端，自然连接转化不成功； 4.感受态质量可通过平行用未酶切的载体作为对照，应该长出很多阳性克隆，若对照都没长，自然表明感受态不好； 5.电转化时，由于多数时候用的都是反复使用的旧电转杯，而电极铝片氧化严重，再按常规电转参数自然效率不高，可用细砂纸打磨下电极除掉氧化层，外侧方便打磨，内侧可将砂纸裁成小条，用硬薄片物顶住轻轻打磨好，再用DDW冲洗干净，超净工作台内紫外灯照射并吹干后再用。 6.若你的实验室不差钱，对于用pET原始载体进行双酶切的操作可再酶切1.5h后加入碱性磷酸酶（如FastAP）进行脱磷酸处理，65℃灭活后再胶回收，连接时比例用载体/基因=1:1比例连接，再转化。 祝你实验顺利！ |
9楼2018-11-19 10:21:04
