| 查看: 4180 | 回复: 8 | |||
[求助]
NdeI,BamHI双酶切
|
|||
| 我用NedI和BamHI双酶切我的目的片段然后和28a连接。试着改变了多次酶切酶连条件，但一直都转化不出来。28a切完后跑电泳与质粒比较应该是切开的。现在不知道问题到底是出在哪里了。求各位帮忙分析一下，可能的原因以及解决的方案吧~谢谢~~感激不尽！ |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有267人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
关于双酶切作用时间
已经有10人回复- 载体上临近的两个酶切位点可以设计起来做双酶切吗？
已经有12人回复
- 有关NEB内切酶NdeI和XhoI的双酶切问题
已经有6人回复
- 重组质粒单双酶切结果一样，奇怪了的……
已经有15人回复
- 双酶切没有切开，怎么回事啊
已经有6人回复
- 关于分步双酶切
已经有7人回复
- 目的片段中含有酶切位点，求解决方案
已经有3人回复
- 双酶切后载体片段变小
已经有8人回复
- 求助关于双酶切空载跑胶没有条带！
已经有15人回复
- Hind111 与 Not1双酶切请教 急急急！！！
已经有13人回复
- 双酶切看不到小片段，为什么？
已经有19人回复
- 关于EcoRI的部分酶切
已经有15人回复
- 表达载体双酶切
已经有9人回复
- 双酶切，体系，切不出来
已经有10人回复
- 重组质粒双酶切问题
已经有5人回复
- HindIII酶切基因组DNA
已经有4人回复
- 双酶切体系是什么意思
已经有7人回复
- 求助！请问 NdeI 和EcoRI 同时做酶切可以吗？
已经有3人回复
- 【求助/交流】BamHI酶切
已经有27人回复
- 【求助/交流】怎样才能把HINDIII marker跑好
已经有7人回复
4楼2013-08-15 14:48:07
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24326.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
2楼2013-08-14 18:06:44
hermain
木虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 1765.5
- 帖子: 97
- 在线: 307.4小时
- 虫号: 1418365
- 注册: 2011-09-26
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2013-08-15 13:35:40
RUI1990
银虫 (小有名气)
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 359.4
- 帖子: 61
- 在线: 114.7小时
- 虫号: 2408840
- 注册: 2013-04-09
- 性别: MM
- 专业: 天然药物化学
5楼2013-08-15 14:54:53
hermain
木虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 1765.5
- 帖子: 97
- 在线: 307.4小时
- 虫号: 1418365
- 注册: 2011-09-26
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
6楼2013-08-15 15:33:42
hermain
木虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 1765.5
- 帖子: 97
- 在线: 307.4小时
- 虫号: 1418365
- 注册: 2011-09-26
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
7楼2013-08-15 15:39:22
|
1、用通用缓冲液进行双酶切，酶量不可太多，例如2~3mL培养过夜菌体，Kit提取质粒用40uLDDW洗脱下来，可加NdeI 2~3U，BamHI 1~2U,混匀后37℃，酶切1.5h即可，酶量不能太多，酶切时间不宜太长； 2、胶回收不要用低熔点琼脂糖，譬如用Agarose H，胶浓度用0.5%，胶长度~15~20cm(可将常用的两灌胶槽用胶带串接在一起)，准备冷冻的电极缓冲液中间更换缓冲液，或冻制缓冲冰块，中间加入冷却，电压用120~140V，电泳时间~1.5-2.5h,注意除了电Marker样品外，还带上未酶切的载体样作对比； 3、用常规胶回收试剂盒回收，熔胶稳定控制在50℃左右，6~10mins，柱中目标片段用30uL水洗脱下来，一定要电泳检视，取3~5ul点样，应该条带清晰，无降解和聚集等杂带； 4、待插入的双酶切目标基因按常规操作，最后回收样也要电泳检视质量可靠后，再与载体连接。 |
8楼2018-11-19 09:52:27
|
1.如果你有含插入基因（最好大于1kb，愈大更好）的pET类载体，还可再用NdeI/BamHI双切则比较方便，直接用NdeI/BamHI双切，低浓度加长胶电泳可回收到酶切好的高质量的pET-NdeI/BamHI备用载体；若只有原始载体，因为NdeI或BamHI均不能保证100%切开，特别NdeI大致只有70%，因此你双酶切的载体中大致有30%的载体仅仅是完成单切，因此你的载体再连接时，相当于连接液中原始载体特别高，而目的连接载体不多，需要筛选比较多的克隆才可能筛选到你的目标克隆； 2.其次，由于插入用载体质量差，连接时还是按连接说明书中载体/基因=1:5的比例，那么合格的连接所占比例就非常低，转化筛选自然困难；此时可用可用1:1或2:1比例； 3.NdeI的保护碱基比较特别，可在百度中输入“限制性内切酶保护碱基”，可查找到有关保护碱基设计的文章参考，不然你的插入基因根本就没有NdeI粘端，自然连接转化不成功； 4.感受态质量可通过平行用未酶切的载体作为对照，应该长出很多阳性克隆，若对照都没长，自然表明感受态不好； 5.电转化时，由于多数时候用的都是反复使用的旧电转杯，而电极铝片氧化严重，再按常规电转参数自然效率不高，可用细砂纸打磨下电极除掉氧化层，外侧方便打磨，内侧可将砂纸裁成小条，用硬薄片物顶住轻轻打磨好，再用DDW冲洗干净，超净工作台内紫外灯照射并吹干后再用。 6.若你的实验室不差钱，对于用pET原始载体进行双酶切的操作可再酶切1.5h后加入碱性磷酸酶（如FastAP）进行脱磷酸处理，65℃灭活后再胶回收，连接时比例用载体/基因=1:1比例连接，再转化。 祝你实验顺利！ |
9楼2018-11-19 10:21:04