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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » NdeI,BamHI双酶切
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大脸猫猫喵

金虫 (初入文坛)

[求助] NdeI,BamHI双酶切

我用NedI和BamHI双酶切我的目的片段然后和28a连接。试着改变了多次酶切酶连条件，但一直都转化不出来。28a切完后跑电泳与质粒比较应该是切开的。现在不知道问题到底是出在哪里了。求各位帮忙分析一下，可能的原因以及解决的方案吧~谢谢~~感激不尽！
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1楼 2013-08-14 17:19:07
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hermain

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不是说转化都还没有出来吗？应该还没有到目的蛋白表达这一步吧。你分步酶切后确定切下来了吗？如果是切下来的话，那就再调整一下连接体系吧，尤其要注意摩尔比，说不定是没有连接上。
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7楼2013-08-15 15:39:22
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
大脸猫猫喵: 金币+1, ★有帮助, 这个都是做过的，都是没有问题的~ 2013-08-14 18:25:09
有没有做阳性对照（转pET28a空载体）来排除你平板抗性没用错和感受态细胞良好
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-08-14 18:06:44
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hermain

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
大脸猫猫喵: 金币+1, ★有帮助, 我分步酶切试过的，但还是不行。我感觉可能是我的目的蛋白二级结构上的问题，但这方面我不懂，也不知道怎么样处理。 2013-08-15 13:54:49
目的片段切下来以后跑电泳看过了吗？有可能是双酶切不完全。NedI和BamHI双酶切的切割效率可能比较低，要不就用分步酶切的方法试一试。
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3楼2013-08-15 13:35:40
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cookee1981

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-15 16:47:25
gyesang: 回帖置顶 2013-08-15 16:47:37
gyesang: 很好的建议，楼主可以考虑 2013-08-15 16:53:39
你的目的片段是PCR产物还是已经连在了克隆载体上？如果是直接用PCR产物进行酶切，可能会比较困难，而且要看你有没有在酶切位点两端加上保护碱基。如果是从克隆载体上双酶切，那就要测序检查一下酶切位点是否为唯一的在目的片段两端。
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4楼2013-08-15 14:48:07
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