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大脸猫猫喵

金虫 (初入文坛)

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虫号: 1809561
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专业: 色谱分析

[求助] NdeI,BamHI双酶切

我用NedI和BamHI双酶切我的目的片段然后和28a连接。试着改变了多次酶切酶连条件，但一直都转化不出来。28a切完后跑电泳与质粒比较应该是切开的。现在不知道问题到底是出在哪里了。求各位帮忙分析一下，可能的原因以及解决的方案吧~谢谢~~感激不尽！

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1楼2013-08-14 17:19:07

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hxd2002

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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帖子: 3
在线: 43分钟
虫号: 1877321
注册: 2012-07-03
性别: GG
专业: 生物化学

1.如果你有含插入基因（最好大于1kb，愈大更好）的pET类载体，还可再用NdeI/BamHI双切则比较方便，直接用NdeI/BamHI双切，低浓度加长胶电泳可回收到酶切好的高质量的pET-NdeI/BamHI备用载体；若只有原始载体，因为NdeI或BamHI均不能保证100%切开，特别NdeI大致只有70%，因此你双酶切的载体中大致有30%的载体仅仅是完成单切，因此你的载体再连接时，相当于连接液中原始载体特别高，而目的连接载体不多，需要筛选比较多的克隆才可能筛选到你的目标克隆；
2.其次，由于插入用载体质量差，连接时还是按连接说明书中载体/基因=1:5的比例，那么合格的连接所占比例就非常低，转化筛选自然困难；此时可用可用1:1或2:1比例；
3.NdeI的保护碱基比较特别，可在百度中输入“限制性内切酶保护碱基”，可查找到有关保护碱基设计的文章参考，不然你的插入基因根本就没有NdeI粘端，自然连接转化不成功；
4.感受态质量可通过平行用未酶切的载体作为对照，应该长出很多阳性克隆，若对照都没长，自然表明感受态不好；
5.电转化时，由于多数时候用的都是反复使用的旧电转杯，而电极铝片氧化严重，再按常规电转参数自然效率不高，可用细砂纸打磨下电极除掉氧化层，外侧方便打磨，内侧可将砂纸裁成小条，用硬薄片物顶住轻轻打磨好，再用DDW冲洗干净，超净工作台内紫外灯照射并吹干后再用。
6.若你的实验室不差钱，对于用pET原始载体进行双酶切的操作可再酶切1.5h后加入碱性磷酸酶（如FastAP）进行脱磷酸处理，65℃灭活后再胶回收，连接时比例用载体/基因=1:1比例连接，再转化。
祝你实验顺利！