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大脸猫猫喵

金虫 (初入文坛)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 520.4
帖子: 17
在线: 13.4小时
虫号: 1809561
注册: 2012-05-11
性别: MM
专业: 色谱分析

[求助] NdeI,BamHI双酶切

我用NedI和BamHI双酶切我的目的片段然后和28a连接。试着改变了多次酶切酶连条件，但一直都转化不出来。28a切完后跑电泳与质粒比较应该是切开的。现在不知道问题到底是出在哪里了。求各位帮忙分析一下，可能的原因以及解决的方案吧~谢谢~~感激不尽！

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1楼2013-08-14 17:19:07

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hxd2002

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 0.5
帖子: 3
在线: 43分钟
虫号: 1877321
注册: 2012-07-03
性别: GG
专业: 生物化学

1、用通用缓冲液进行双酶切，酶量不可太多，例如2~3mL培养过夜菌体，Kit提取质粒用40uLDDW洗脱下来，可加NdeI 2~3U，BamHI 1~2U,混匀后37℃，酶切1.5h即可，酶量不能太多，酶切时间不宜太长；
2、胶回收不要用低熔点琼脂糖，譬如用Agarose H，胶浓度用0.5%，胶长度~15~20cm(可将常用的两灌胶槽用胶带串接在一起)，准备冷冻的电极缓冲液中间更换缓冲液，或冻制缓冲冰块，中间加入冷却，电压用120~140V，电泳时间~1.5-2.5h,注意除了电Marker样品外，还带上未酶切的载体样作对比；
3、用常规胶回收试剂盒回收，熔胶稳定控制在50℃左右，6~10mins，柱中目标片段用30uL水洗脱下来，一定要电泳检视，取3~5ul点样，应该条带清晰，无降解和聚集等杂带；
4、待插入的双酶切目标基因按常规操作，最后回收样也要电泳检视质量可靠后，再与载体连接。