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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒双酶切BSA怎么加？
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小虫子MM

铜虫 (初入文坛)

[求助] 质粒双酶切BSA怎么加？

各位同学，我做的是双酶切，用NcoⅠ和XhoⅠ俩个酶，用的BUFFER写的是1×K+BSA，请问一下这个酶切体体系是什么啊？BSA加多少量啊？比如我总体系想切5μL！请同学们帮忙知道下！以前没加BSA的酶切体系如下：质粒3uL，水：1uL，buffer：0.5uL，酶各0.25uL！
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1楼 2013-04-07 12:58:45
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wanglei512

金虫 (正式写手)
NcoⅠ         0.5   UL      
XhoⅠ         0.5   UL
buffer K        2    UL
BSA             2    UL
DNA            <1ug
水              补至20ul
这是TAKARA的酶切
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8楼2013-04-08 08:44:48
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小科研女dow

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-04-07 17:21:24
小虫子MM: 金币+1, ★有帮助 2013-04-11 17:34:57
做双酶切的话 要先确定两种酶的环境是不是一样
一般如果不一样的话
就要看单买来的酶的说明书了
每次买来的酶都会相应的将所需要的缓冲液及其别的所需东西一并在内
自己只需要看所提供的体系自行设计就好
因为一般的酶的含量都是及其少的但是缓冲液及其别的东西很多
一般实验室会遇见总是酶不见了 其他的都东西却很多
所以如果有师姐师兄的话 建议问一下
如果没有就去自己买酶或者咨询一下买的公司 看看买来是都包括什么成分
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做出色的科研人
5楼2013-04-07 16:06:17
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夏尔list

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小虫子MM: 金币+1, ★有帮助 2013-04-11 17:35:09
我们用的是TAKARA的酶，BSA是分开的，加的量和buffer是一样的
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6楼2013-04-07 17:53:29
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小虫子MM: 金币+2, ★有帮助 2013-04-11 17:35:20
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小虫子MM at 2013-04-07 14:52:25
我们买的酶，比如XhoⅠ，袋里就带有0.1%的BSA啊...

体系跟buffer一样    加1/10的量
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hold住
7楼2013-04-07 20:20:14
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爱上文慧

银虫 (小有名气)
你的k+BSA上面写得是不是10X或5X之类的，那就按照比例稀释就可以了，假如是10X，5μ的体系，你只要加0.5μ就得到1X的了。
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每一个你讨厌的现在都有一个不努力的曾经
9楼2013-04-08 09:05:11
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Leo_xin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
K+BSA  估计你用的TAKARA公司的酶。

buffer一般是10乘的，BSA一般是100乘的，所以你最后体系里肯定把这两个稀释成1乘。

双酶切的话要看这两种酶的最适温度，buffer是不是一样，如果一样就直接把两种酶一起加。总酶量最好小于体系的10%

如果buffer不一样，那就得加完一种酶后一段时间  过柱回收再加第二种酶（换buffer）

如果温度不一样，buffer一样，那就先加一个酶 一段时间后，  可以选择灭活下  加下一个酶（不用换buffer）
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还有太多地方值得改进。
12楼2013-04-08 12:47:49
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bioyujun

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
8楼: Originally posted by wanglei512 at 2013-04-08 08:44:48
NcoⅠ         0.5   UL      
XhoⅠ         0.5   UL
buffer K        2    UL
BSA             2    UL
DNA            <1ug
水              补至20ul
这是TAKARA的酶切

正解，我就这么做没问题

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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14楼2013-04-10 07:51:20
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普通回帖

shangrila911

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励应助，分子生物版块，期待你的精彩。 2013-04-07 13:47:03
小虫子MM: 金币+1, ★有帮助 2013-04-11 17:36:25
K+BSA  是一种反应缓冲液 是成品  不是自己可以分开加的
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一切都会好的!
2楼2013-04-07 13:40:30
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小虫子MM

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shangrila911 at 2013-04-07 13:40:30
K+BSA  是一种反应缓冲液 是成品  不是自己可以分开加的

我们买的酶，比如XhoⅠ，袋里就带有0.1%的BSA啊
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3楼2013-04-07 14:52:25
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auroraA

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小虫子MM: 金币+2, ★有帮助 2013-04-11 17:34:41
如果你是做克隆的话,建议你根本就不要加BSA,因为BSA虽然可降低star activity,但是也影响activity. 一般1-2ug的plasmid, 1ul (10u/ul)enzyme, 1hr-1.5hr足够了
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4楼2013-04-07 15:00:03
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爱上文慧

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小虫子MM: 金币+2, ★有帮助 2013-04-11 17:35:33
小虫子MM: 金币+1 2013-04-11 17:36:42
你的k+BSA上面写得是不是10X或5X之类的，那就按照比例稀释就可以了，假如是10X，5μ的体系，你只要加0.5μ就得到1X的了。
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每一个你讨厌的现在都有一个不努力的曾经
10楼2013-04-08 09:05:56
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