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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 菌液pcr,坐等求助
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本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

hajierlove

铜虫 (正式写手)

[求助] 菌液pcr,坐等求助 已有7人参与

今天做的菌液pcr，三个基因挑了48个单克隆，做菌液pcr，引物是M13通用引物，出来的目的条带都是250bp。750bp。目的片段是500bp。怎么回事？只能证明没有连接上吗？
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踏实
1楼 2014-07-23 20:33:08
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回帖置顶 ( 共有2个 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:32:22
个人意见，刚写出来的，边想边写，可能有错，仅供参考。

菌液PCR的假阳性的原因和解决方法(凌波丽，2014年7月24日)

1.建议楼主做阴性对照，阳性对照，检查是否存在污染。
2.假阳性可能的来源是未能和载体连接上的插入片段，这不相当于普通PCR的模板提取的那一步，这步的关键可能是保证挑的细菌克隆的确都能保证是阳性克隆。
3.菌液PCR假阳性也可能是引物设计有问题，引起不专一性PCR扩增。
4.可以加强DNA聚合酶的专一性（这步和普通PCR相同）：
    （1）Taq DNA聚合酶的专一性扩增不够。改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。
    （2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入菌液PCR反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
    （3）在反应体系中加入：1.0mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以稳定 DNA聚合酶。
5.是否存在菌液PCR的反应体系之外的DNA污染源
    菌液PCR的反应体系被污染：这种污染有两种原因：
    第一种可能：大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。
    这种非特异性带出现可用以下方法解决：
   （1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止以前操作时将其他的DNA靶序列吸入加样枪内。
   （2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
   （3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
    第二种可能：空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。
    对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间。
6.反应体系过大，模板DNA和非模板DNA过多引起了非特异性扩增。
7.目的DNA模板可能本身存在某些问题，比如与一些蛋白质发生了较牢固的结合（特异性或者非特异性）-----因为细菌也有类核，而这样的结合在裂解细菌由于某些因素没有去除，或者目的DNA模板的拓扑结构有某些问题。第7点只是我从细菌分子生物学角度做的猜测。第7条成为原因的可能性极小。
      因为如果挑的阳性克隆没有问题，同时PCR的引物也肯定能够与目的模板互补的话，那么出现目的DNA扩增片段应该不是问题，也可能有非特异性扩增存在，但是只有非特异性扩增的话，所以此时就要考虑什么原因阻止了目的DNA的扩增。
8.引物的特异性差，受非特异性的PCR扩增的竞争性抑制作用的影响，靶基因的PCR扩增效率低，特异性的PCR产物极少。第1条措施到第6条措施均无效，则必须考虑重新设计引物。
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8楼2014-07-24 02:25:30
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:31:19
gyesang: 回帖置顶 2014-07-24 17:00:14
你说条带是同一孔有250+750还是有的是250有的是750？胶图片可以放上来看一下
通用引物一般距离连接点都有几十个bp的距离，上下游加起来差个一两百是可能的，750bp有可能是对的
做菌液pcr最好是用通用引物和你的引物混搭，比如用通用上游引物和你的基因片段下游引物，当然这样子会导致你得到的阳性克隆减少一半。因为这是定向pcr，如果你的ORF克隆到载体里面是反向的话不会被扩增。但是应该可以给你足够多的阳性克隆了。换别的搭配也行，这样子的话准确性会高一些
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
9楼2014-07-24 03:38:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:31:49
你的载体是哪个牌子的？如果是pMD19-T的话一般用M13通用引物的话除了你的目的基因在基因两端会多扩出150bp以上的一段载体片段，所以你的那个750bp的片段可能是对的，而你的那个250bp的片段可能扩的是空载体。
拿你扩增出750bp片段的菌再用你扩基因的引物做个菌落PCR，或者直接提取质粒双酶切验证都可以，只要大小正确就可以去测序了。
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大家相互帮助哈
5楼2014-07-23 22:37:42
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lijianfu12

银虫 (正式写手)
你用自己的引物跑p呀！干嘛用m13

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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好好搞学术
2楼2014-07-23 21:26:20
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普通回帖

胡亚梅

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:31:32
引物特异性不行啊，建议自己根据目的条带设计会更靠谱一些
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小虫虫~~
3楼2014-07-23 21:40:31
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:31:40
做阴性对照了吗？用的是什么T载体？查下通用引物之间的距离。
应该是连接转化成功了，M13通用引物扩增空载体的产物大小一般是200bp左右。这样加上你的目的片段大小应该就是对的。
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4楼2014-07-23 22:23:16
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR扩增后目的带未出现而出现非特异性扩增带（作者：凌波丽)

2013年11月8日

PCR扩增后目的带未出现而出现非特异性扩增带，其原因与对策如下：

I.引物的特异性差，受非特异性的PCR扩增的竞争性抑制作用的影响，靶基因的PCR扩增效率低，特异性的PCR产物极少。可能的具体原因和对策如下：
    1.设立阳性和阴性对照，检查反应体系是否被污染。如果被污染则采用相应的对策消除污染。具体见“二”。
    2.加强DNA聚合酶的专一性。
    （1）Taq DNA聚合酶的专一性扩增不够。改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。
    （2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
    （3）在反应体系中加入：1.0mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以稳定 DNA聚合酶。
    3.缩短退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。
    4.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。
（1）使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
（2）使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。
5.适当减少DNA模板量和四中脱氧核苷酸的浓度也能够一定程度上减少非特异性扩增。
II.反应体系被污染：这种污染有两种原因：
    1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。
    这种非特异性带出现可用以下方法解决：
   （1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
   （2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
   （3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
   （4）重新提取模板DNA。
    2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。
    对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。

前面所有措施都不行，那就只好重新设引物了。本文是2013年11月8日重新编辑的。
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6楼2014-07-24 00:51:26
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
不好意思！答错了，我没有看到菌液，我打的是普通PCR。
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7楼2014-07-24 00:58:25
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-24 03:38:57
你说条带是同一孔有250+750还是有的是250有的是750？胶图片可以放上来看一下
通用引物一般距离连接点都有几十个bp的距离，上下游加起来差个一两百是可能的，750bp有可能是对的
做菌液pcr最好是用通用引物和你的引 ...

不是一个孔，是说，两种引物都加吗？谢谢亲的回来，非常满意

[ 发自小木虫客户端 ]
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踏实
10楼2014-07-24 03:45:14
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