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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 菌液pcr,坐等求助
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:32:44
引用回帖:
10楼: Originally posted by hajierlove at 2014-07-24 03:45:14
不是一个孔，是说，两种引物都加吗？谢谢亲的回来，非常满意
...

举例来说，pGEM-T载体的T7（上游引物）和SP6（下游引物）相隔大概有150bp，所以如果用这对引物的话，得到的产物肯定是大于你的目的基因的。
定向PCR的方法是：假设你需要你的目的基因ORF和载体是同向，那么你可以用这两种搭配 - T7+你的基因下游引物 或者 你的基因上游引物+SP6。这样一来，只有当你的基因是以和载体同向插入的时候才会有扩增产物。如果你的基因和载体反向插入，那么这两种组合等于是两个引物阅读顺序相同，所以无法扩增。这样做法的好处就是，基本保证只要能扩增出来就说明插入成功。不好之处在于，理论上筛选了一半的扩增产物，因为你其实对基因的正反向是没有要求的。只有你需要克隆表达载体的时候，才需要要求基因的ORF方向与载体方向相同。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
11楼2014-07-24 04:24:05
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三蛰

铜虫 (小有名气)
都是些神仙呀。。。。
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我不会！
12楼2014-07-24 09:24:48
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-24 04:24:05
举例来说，pGEM-T载体的T7（上游引物）和SP6（下游引物）相隔大概有150bp，所以如果用这对引物的话，得到的产物肯定是大于你的目的基因的。
定向PCR的方法是：假设你需要你的目的基因ORF和载体是同向，那么你可以 ...

为什么之前菌液PCR出来的直接是目的条带

[ 发自小木虫客户端 ]
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踏实
13楼2014-07-24 10:13:53
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人偶骑士

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-24 17:01:06
250bp的大概是空载吧，没连接成功，750bp的有可能是对的，因为载体片段大概就有250bp
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道之所在，虽千万人吾往矣！
14楼2014-07-24 16:06:53
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-24 21:32:55
引用回帖:
13楼: Originally posted by hajierlove at 2014-07-24 10:13:53
为什么之前菌液PCR出来的直接是目的条带
...

“直接是目的条带”一般是不太可能的，载体的通用引物很少是直接从连接点就开始，除非是你自己设计的引物紧挨着连接位点。之所以看起来是，是因为仅用ladder来确定pcr产物的大小并不是非常精准的，有误差是很正常的事情。你可以试试用你自己引物的pcr产物和通用引物的pcr产物同时跑胶，只要你跑的时间够长，绝对可以看出不同的。只不过片段越大，由引物多扩增出来那1、200bp就越不显著了。这个好理解，100bp和200bp很容易区分，1kbp和1.1kbp就没那么容易分离了。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
15楼2014-07-24 19:10:24
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-24 21:33:25
引用回帖:
8楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-24 02:25:30
个人意见，刚写出来的，边想边写，可能有错，仅供参考。

菌液PCR的假阳性的原因和解决方法(凌波丽，2014年7月24日)

1.建议楼主做阴性对照，阳性对照，检查是否存在污染。
2.假阳性可能的来源是未能和载体连接 ...

搞个最简单的菌液PCR，版主你想多了，如果是转基因检测等很严谨的实验尚可考虑，一般的菌液PCR做不出来，只能说你还没学会，经验积累不够。我们做克隆后，菌液PCR就用国产的mix，很便宜，尽量用通用引物，做了这么多年，一直都OK的，没说要换好酶，加这个试剂那个试剂的。我们加样就在外面加的，跑电泳结果以及测序都很ok的。最后，我只能弱弱的说一句，信文献说的不如信自己做的。

[ 发自小木虫客户端 ]
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16楼2014-07-24 21:16:59
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-24 02:25:30
个人意见，刚写出来的，边想边写，可能有错，仅供参考。

菌液PCR的假阳性的原因和解决方法(凌波丽，2014年7月24日)

1.建议楼主做阴性对照，阳性对照，检查是否存在污染。
2.假阳性可能的来源是未能和载体连接 ...

谢谢亲如此真诚的回复，真心谢谢，祝工作顺利
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踏实
17楼2014-07-24 22:16:27
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lijianfu12 at 2014-07-23 21:26:20
你用自己的引物跑p呀！干嘛用m13

自己的引物不好控制退火温度吧，M13是载体上的引物，特异性更强
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踏实
18楼2014-07-24 22:18:23
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2014-07-23 22:23:16
做阴性对照了吗？用的是什么T载体？查下通用引物之间的距离。
应该是连接转化成功了，M13通用引物扩增空载体的产物大小一般是200bp左右。这样加上你的目的片段大小应该就是对的。

150bp左右
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踏实
19楼2014-07-24 22:19:01
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-07-24 21:16:59
搞个最简单的菌液PCR，版主你想多了，如果是转基因检测等很严谨的实验尚可考虑，一般的菌液PCR做不出来，只能说你还没学会，经验积累不够。我们做克隆后，菌液PCR就用国产的mix，很便宜，尽量用通用引物，做了这么 ...

是的，我也觉得技术已经很成熟了，是自己经验不够。
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踏实
20楼2014-07-24 22:24:14
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