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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 菌液pcr,坐等求助
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

[求助] 菌液pcr,坐等求助 已有7人参与

今天做的菌液pcr，三个基因挑了48个单克隆，做菌液pcr，引物是M13通用引物，出来的目的条带都是250bp。750bp。目的片段是500bp。怎么回事？只能证明没有连接上吗？
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踏实
1楼 2014-07-23 20:33:08
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-24 21:32:55
引用回帖:
13楼: Originally posted by hajierlove at 2014-07-24 10:13:53
为什么之前菌液PCR出来的直接是目的条带
...

“直接是目的条带”一般是不太可能的，载体的通用引物很少是直接从连接点就开始，除非是你自己设计的引物紧挨着连接位点。之所以看起来是，是因为仅用ladder来确定pcr产物的大小并不是非常精准的，有误差是很正常的事情。你可以试试用你自己引物的pcr产物和通用引物的pcr产物同时跑胶，只要你跑的时间够长，绝对可以看出不同的。只不过片段越大，由引物多扩增出来那1、200bp就越不显著了。这个好理解，100bp和200bp很容易区分，1kbp和1.1kbp就没那么容易分离了。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
15楼2014-07-24 19:10:24
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lijianfu12

银虫 (正式写手)
你用自己的引物跑p呀！干嘛用m13

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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好好搞学术
2楼2014-07-23 21:26:20
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胡亚梅

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:31:32
引物特异性不行啊，建议自己根据目的条带设计会更靠谱一些
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小虫虫~~
3楼2014-07-23 21:40:31
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:31:40
做阴性对照了吗？用的是什么T载体？查下通用引物之间的距离。
应该是连接转化成功了，M13通用引物扩增空载体的产物大小一般是200bp左右。这样加上你的目的片段大小应该就是对的。
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4楼2014-07-23 22:23:16
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