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hajierlove铜虫 (正式写手)
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[求助]
菌液pcr,坐等求助 已有7人参与
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| 今天做的菌液pcr，三个基因挑了48个单克隆，做菌液pcr，引物是M13通用引物，出来的目的条带都是250bp。750bp。目的片段是500bp。怎么回事？只能证明没有连接上吗？ |
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:32:44
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:32:44
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举例来说，pGEM-T载体的T7（上游引物）和SP6（下游引物）相隔大概有150bp，所以如果用这对引物的话，得到的产物肯定是大于你的目的基因的。 定向PCR的方法是：假设你需要你的目的基因ORF和载体是同向，那么你可以用这两种搭配 - T7+你的基因下游引物 或者 你的基因上游引物+SP6。这样一来，只有当你的基因是以和载体同向插入的时候才会有扩增产物。如果你的基因和载体反向插入，那么这两种组合等于是两个引物阅读顺序相同，所以无法扩增。这样做法的好处就是，基本保证只要能扩增出来就说明插入成功。不好之处在于，理论上筛选了一半的扩增产物，因为你其实对基因的正反向是没有要求的。只有你需要克隆表达载体的时候，才需要要求基因的ORF方向与载体方向相同。 |
11楼2014-07-24 04:24:05
lijianfu12
银虫 (正式写手)
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- 专业: 植物生理与生化
2楼2014-07-23 21:26:20
3楼2014-07-23 21:40:31
4楼2014-07-23 22:23:16