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hajierlove铜虫 (正式写手)
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[求助]
菌液pcr,坐等求助 已有7人参与
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| 今天做的菌液pcr，三个基因挑了48个单克隆，做菌液pcr，引物是M13通用引物，出来的目的条带都是250bp。750bp。目的片段是500bp。怎么回事？只能证明没有连接上吗？ |
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:31:19
gyesang: 回帖置顶 2014-07-24 17:00:14
感谢参与，应助指数 +1
hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:31:19
gyesang: 回帖置顶 2014-07-24 17:00:14
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你说条带是同一孔有250+750还是有的是250有的是750？胶图片可以放上来看一下 通用引物一般距离连接点都有几十个bp的距离，上下游加起来差个一两百是可能的，750bp有可能是对的 做菌液pcr最好是用通用引物和你的引物混搭，比如用通用上游引物和你的基因片段下游引物，当然这样子会导致你得到的阳性克隆减少一半。因为这是定向pcr，如果你的ORF克隆到载体里面是反向的话不会被扩增。但是应该可以给你足够多的阳性克隆了。换别的搭配也行，这样子的话准确性会高一些 |
9楼2014-07-24 03:38:57
【答案】应助回帖
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:32:44
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:32:44
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举例来说，pGEM-T载体的T7（上游引物）和SP6（下游引物）相隔大概有150bp，所以如果用这对引物的话，得到的产物肯定是大于你的目的基因的。 定向PCR的方法是：假设你需要你的目的基因ORF和载体是同向，那么你可以用这两种搭配 - T7+你的基因下游引物 或者 你的基因上游引物+SP6。这样一来，只有当你的基因是以和载体同向插入的时候才会有扩增产物。如果你的基因和载体反向插入，那么这两种组合等于是两个引物阅读顺序相同，所以无法扩增。这样做法的好处就是，基本保证只要能扩增出来就说明插入成功。不好之处在于，理论上筛选了一半的扩增产物，因为你其实对基因的正反向是没有要求的。只有你需要克隆表达载体的时候，才需要要求基因的ORF方向与载体方向相同。 |
11楼2014-07-24 04:24:05
【答案】应助回帖
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-24 21:32:55
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-24 21:32:55
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“直接是目的条带”一般是不太可能的，载体的通用引物很少是直接从连接点就开始，除非是你自己设计的引物紧挨着连接位点。之所以看起来是，是因为仅用ladder来确定pcr产物的大小并不是非常精准的，有误差是很正常的事情。你可以试试用你自己引物的pcr产物和通用引物的pcr产物同时跑胶，只要你跑的时间够长，绝对可以看出不同的。只不过片段越大，由引物多扩增出来那1、200bp就越不显著了。这个好理解，100bp和200bp很容易区分，1kbp和1.1kbp就没那么容易分离了。 |
15楼2014-07-24 19:10:24