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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于PCR连接后菌液鉴定的问题
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哈皮Bingo

银虫 (初入文坛)

[求助] 关于PCR连接后菌液鉴定的问题 已有10人参与

PCR连接完成后，质粒转化入感受态细胞培养出单菌落后，进行菌液鉴定并跑胶，出现的条带大小是不是应该是目的片段加两引物大小？
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1楼 2014-05-13 15:52:51
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
哈皮Bingo(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-13 17:59:15
条带大小应该是你PCR目的片段加酶切后质粒之和，引物一般只有20几bp，建议你用提取出来的质粒为模版，用你PCR的上下游引物进行PCR，能P出条带说明连接上了，之后最好送去测序，看有没有位点突变。（你提问很模糊，你是不是就是做的菌液PCR？）
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2楼2014-05-13 16:05:11
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亦逐日

金虫 (小有名气)
PCR连接完成？好难啊
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道可道，非常道
3楼2014-05-13 16:18:46
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
哈皮Bingo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-13 17:59:33
看你用什么载体了，载体上两引物之间的距离加片段长度即可

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2014-05-13 17:32:57
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
哈皮Bingo(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-05-14 09:06:48
跑电泳，条带有偏差很正常，原因很多，不要纠结。
我分享我的一个protocl，插入片段大于1000bp都能用。
1、连接转化后挑单克隆到500ul培养液中（用1.5mlEP管即可）
2、摇4-5h后，取80ul菌液。
3、80ul菌液+20ul裂解液（主要成分是SDS和NaOH，自己去网上着配方。可以用苯酚代替）+20ul loading buffer。
4、震荡15s，短暂离心。取20ul上清电泳。点样的时候，一定要点空质粒做对照。
一般会有4条带，从上到下依次为细菌基因组、质粒、28sRNA，18sRNA。和空质粒做对照，出现比空质粒跑的慢的带，即为阳性克隆。
5、送100ul菌液测序，订单上注明返质粒。连提质粒都省了。
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5楼2014-05-13 18:15:41
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-13 18:15:41
跑电泳，条带有偏差很正常，原因很多，不要纠结。
我分享我的一个protocl，插入片段大于1000bp都能用。
1、连接转化后挑单克隆到500ul培养液中（用1.5mlEP管即可）
2、摇4-5h后，取80ul菌液。
3、80ul菌液+20ul ...

这种就是质粒快速检测。实际就是手提质粒的前几步，我以前试过效果不错，只是电泳图不如提取的质粒清楚而已。
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大家相互帮助哈
6楼2014-05-13 18:34:32
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哈皮Bingo

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-05-13 16:05:11
条带大小应该是你PCR目的片段加酶切后质粒之和，引物一般只有20几bp，建议你用提取出来的质粒为模版，用你PCR的上下游引物进行PCR，能P出条带说明连接上了，之后最好送去测序，看有没有位点突变。（你提问很模糊，你 ...

我是载体和目的片段连接这步做完后，转入感受态中，然后将培养出来的单克隆挑菌落出来加入到鉴定体系（包含上下游引物）中，反应完成加热后直接拿去跑胶
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7楼2014-05-13 19:05:25
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哈皮Bingo

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-13 17:32:57
看你用什么载体了，载体上两引物之间的距离加片段长度即可

用的pET28a，什么叫载体上两引物之间的距离？
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8楼2014-05-13 19:07:44
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906394648

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
哈皮Bingo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-14 09:07:05
你可以自己双酶切跑胶看看，但是最好的是送去测序，生工和华大测序我都用过，还行，建议试试
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9楼2014-05-13 19:44:20
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 哈皮Bingo at 2014-05-13 19:05:25
我是载体和目的片段连接这步做完后，转入感受态中，然后将培养出来的单克隆挑菌落出来加入到鉴定体系（包含上下游引物）中，反应完成加热后直接拿去跑胶...

就是菌液PCR，条带是目的片段加两引物大小
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10楼2014-05-13 21:42:11
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